ADP-ribosylace histonů během oprav poškozené DNA

Abstract

ADP-ribosylace je reverzibilní posttranslační modifikace, která reguluje nespočet procesů v buňce, včetně oprav poškozené DNA. Teoretická část bakalářské práce je věnována podrobnému popisu ADP-ribosylace. Je zde charakteristika jednotlivých ADP ribosyl transferáz, ADP-ribosyl hydroláz, proteinových domén a motivů vázajících ADP-ribózu. Část práce se zabývá popisem jednovláknového poškození DNA a mechanismem jeho opravy, na kterém se ADP-ribosylace podílí. Jsou zde popsána neurodegenerativní poškození, která mohou vznikat jako důsledek mutací v procesu jednovláknových oprav poškozené DNA nebo vlivem chyb v metabolismu ADP ribosylace. Praktická část práce se zabývá charakterizací ARH3 deficientních buněk, průkazem mono-ADP-ribosylace jako posttranslační modifikace, a detekcí konkrétních ADP ribosylovaných histonů a dalších proteinů. Podařilo se prokázat, že ARH3 deficientní buňky upravené metodou CRISPR/Cas9 netvoří protein ARH3, který je zodpovědný za odstraňování terminálních ADP-ribóz ze substrátů. Nahromaděné mono-ADP-ribosylace uvnitř jader ARH3 deficientních buněk byly detekovány imunofluorescencí a analyzovány s použitím speciálního fluorescenčního mikroskopu. Testován byl nový inhibitor ARH3 (AI26), jehož účinnost v buňkách se nepotvrdila. Pomocí imunoprecipitace s glutathion-sepharosovými kuličkami s navázanou makro doménou Af1521 se podařilo získat ADP-ribosylované proteiny, které byly dále detekovány na hmotnostním spektrometru. Hmotnostní spektrometrie určila jako ADP-ribosylované histony H2B a H3, čímž se potvrdily dřívější hypotézy.

ADP-ribosylation is a reversible posttranslational modification that regulates numerous processes in the cell including the repair of DNA strand breaks. A theoretical part of this bachelor thesis focuses on a detailed description of ADP-ribosylation. Specific ADP-ribosyl transferases, ADP-ribosyl glycohydrolases, protein domains and ADP-ribose binding motifs are described in the first part. The second part of the thesis deals with the description of DNA single strand breaks and mechanisms of its repair in which ADP-ribosylation is involved. The thesis also introduces neurodegenerative diseases that are associated with mutations in DNA single-strand break repair proteins or in enzymes regulating ADP-ribose metabolism. The experimental part of the thesis deals with the characterization of ARH3 deficient cells, the detection of mono-ADP-ribosylation, and the identification of specific ADP-ribosylated histones and other proteins. Here, it is shown that ARH3 deficient cells in which ARH3 was deleted using CRISPR/Cas9-mediated genome editing do not express an ARH3 protein which is responsible for the removal of terminal ADP-ribose from substrates. The accumulation of mono-ADP-ribosylation in nuclei of ARH3 deficient cells was detected by immunofluorescence and analyzed on a high-content fluorescence microscope. A new inhibitor of ARH3 (AI26) was tested, however in conclusion it is not suitable for use in cell culture. ADP-ribosylated proteins were obtained by immunoprecipitation with glutathione-sepharose beads with Af1521 macrodomain and identified by mass spectrometry. Histones H2B and H3 were detected as major hits thus confirming earlier hypotheses.