Detoxikace kyanidu a nitrilů pomocí buněk a enzymů vláknitých hub

Abstract

Literární rešerše shrnuje vlastnosti kyanidu a nitrilů, jejich použití, výskyt a mechanismus jejich toxicity. Dále se věnuje kyanidovému znečištění, jeho právní regulaci v České republice a současným metodám čištění odpadních vod obsahujících kyanidy. Jsou popsány rozkladné dráhy kyanidu a nitrilů přirozeně se vyskytující u některých mikroorganismů. Je posouzen potenciál fungálních enzymů rozkládajících kyanidy a nitrily k detoxikaci odpadních vod a hlušin. Náplní experimentální části byla příprava a stanovení vlastností kyanidhydratázy z houby Exidia glandulosa. Kyanidhydratázy (EC 4.2.1.66) přeměňují kyanid na méně toxický formamid. Vyskytují se v houbách, většinou v oddělení Ascomycota. Zkoumaný enzym je jednou z několika málo kyanidhydratáz z oddělení Basidiomycota. Jeho sekvence byla srovnána se sekvencemi charakterizovaných kyanidhydratáz. Enzym byl heterologně exprimován v buňkách E. coli v objemu 200 ml buněčné kultury. Enzym byl purifikován s 16% výtěžkem. Byla stanovena aktivita buněk s 25 mmol/l substráty, KCN (88,4 ? 2,2 U/mg), fumaronitrilem (0,15 ? 0,03 U/mg) a 2-kyanopyridinem (0,50 ? 0,08 U/mg). Aktivita purifikovaného enzymu s 25 mmol/l KCN byla 811 ? 22 U/mg. Enzym vykazuje nejvyšší aktivity při pH 6,3-10,3 a teplotách 40-45 °C. Jeho stabilita je dostatečná při teplotách 27 a 37 °C. V simulovaných koksárenských a petrochemických odpadních vodách obsahujících fenol, amoniak, thiokyanatan a/nebo sulfid enzym téměř kompletně konvertoval 25 mmol/l KCN.

The literature review summarises cyanide and nitrile properties, their uses and the mechanism of their toxicity. It also focuses on cyanide pollution, its regulation in the Czech Republic and the currently used methods for the treatment of cyanide-containing wastewaters. Various cyanide-degrading pathways naturally occurring in microorganisms are described, as well as cyanide and nitrile remediation potential of fungal enzymes for treatment of wastewaters and tailings. The topic of the experimental part was the preparation of cyanide hydratase from the fungus Exidia glandulosa and the determination of the properties of this enzyme. Cyanide hydratases (EC 4.2.1.66) transform cyanide into the less toxic formamide. They occur in fungi, primarily in the division Ascomycota. The studied enzyme is one of the few cyanide hydratases in the division Basidiomycota. Its sequence was compared with those of characterized cyanide hydratases. The enzyme was heterologously expressed in E. coli cells in 200 ml of culture. It was purified with a yield of 16%. The whole-cell activity towards KCN, fumaronitrile and 2-cyanopyridine (25 mmol/l each) was 88.4 ? 2.2 U/mg, 0.15 ? 0.03 U/mg and 0.50 ? 0.08 U/mg respectively. The activity of the purified enzyme towards 25 mmol/l KCN was 811 ? 22 U/mg. The enzyme exhibits its highest activities within pH 6.3-10.3 and temperatures 40-45 °C. Its stability is sufficient at temperatures 27 and 37 °C. In simulated coke-oven and petrochemical wastewaters containing phenol, ammonia, thiocyanate and/or sulphide, the enzyme almost completely converted 25 mmol/l KCN.