Optimalizace mikroskopického zobrazování technikou TOCCSL

Abstract

Optimalizace mikroskopického zobrazování technikou TOCCSL Tato diplomová práce se zabývá problematikou metod fluorescenční mikroskopie, pomocí kterých je možné detekovat pohyb jednotlivých molekul v reálném čase. Jejím hlavním cílem je vytvořit měřící protokol, který popisuje postup využití metody TOCCSL (Thinning Out Clusters while Conserving the Stoichiometry of Labelling) pro měření nanoskopické organizace gangliosidů v modelových systémech plazmatických membrán. Dále naměřit sérii vzorků a pomocí zpracování v prostředí Matlab určit velikost gangliosidových klastrů, které každý konkrétní vzorek tvoří. Měření probíhala na Ústavu fyzikální chemie J. Heyrovského Akademie věd na fluorescenčním mikroskopu určeném pro metody TIRF a TOCCSL s využitím modrého laseru o vlnové délce 488 nm. Tvorba klastrů byla pozorována u dvou typů gangliosidů, každého na třech různých podpůrných fosfolipidových dvojvrstvách. Zaznamenaná data jsem předzpracovala v prostředí Matlab a dále dopočítala hustotní pravděpodobnostní funkci pro jasové body. Ze získaných výsledků bylo patrné, že každý gangliosid vykazuje jinou ochotu tvořit nanoskopické klastry. Změna ve struktuře lipidové dvojvrstvy, ve které se daný gangliosid vyskytuje, má na nanoskopickou segregaci gangliosidů prokazatelný vliv. Výsledky ukazují, že metoda TOCCSL je vhodná především pro detekci menších a pohyblivějších molekul a tudíž pro vzorky, kde očekáváme nižší ochotu vazebných partnerů.

Optimalization of TOCCSL microscopy This thesis deals with the problematics of fluorescence microscopy techniques that are able to detect the single molecule movement in the real time. The main aim is to create measuring protocol describing usage of TOCCSL (Thinning Out Clusters while Conserving the Stoichiometry of Labelling) method for measuring nanoscopic organisation of gangliosides on synthetic plasmatic membranes. Next aim is to measure several samples and perform the data analysis in Matlab software to define size of ganglioside clusters in each sample. The measurements take place at The Czech Academy of Sciences, J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry using the microscope suited for TIRF and TOCCSL measurements. Cluster formation is observed on three compositions of lipid bilayer and two types of gangliosides. I analysed the acquired data in Matlab and counted the probability density function for brightness spots. The results showed that different gangliosides create clusters of different sizes. Changes in bilayer structures have significant impact on nanoscopic ganglioside segregation. As a result it is possible to claim that TOCCSL method is suitable primarily for detection of smaller and more mobile molecules, therefore is more convenient for samples with lower willingness to bind.