Rekombinantní exprese a charakterizace synteticky zajímavé β-N-acetylhexosaminidasy v Pichia pastoris

Abstract

Abstrakt ?-N-Acetylhexosaminidasa je enzym patřící mezi glykosidasy, které ve volné přírodě glykosidovou vazbu pouze hydrolyzují, ovšem při vhodné úpravě reakčních podmínek jsou schopny ji syntetizovat. ?-N-Acetylhexosaminidasy z vláknitých hub jsou inducibilní extracelulární enzymy. Jsou známé pro svou fyziologickou roli v chitinolytickém systému buněk rostoucích hub - zodpovídají za kontrolu lýzy chitinové buněčné stěny a regulují rekonstituci buněk. V biotechnologii mají potenciální využití v syntéze oligosacharidů díky svým dobrým transglykosylačním schopnostem. K rekombinantní expresi ?-N-acetylhexosaminidas z vyšších organismů, např. hub a plísní, se s výhodou využívá expresního systému kvasinek, např. Pichia pastoris nebo Saccharomyces cerevisiae. Houbová ?-N-acetylhexosaminidasa z Penicillium oxalicum je zajímavým enzymem pro případné biotechnologické využití díky své vysoké GalNAcasové aktivitě, široké substrátové specifitě a dobré pH stabilitě. V této práci byl rekombinantní expresí produkován enzym ?-N-acetylhexosaminidasa z Penicillium oxalicum za využití expresního systému kvasinek Pichia pastoris. Rekombinantní enzym byl produkován ve větším množství i čistotě než původní houbový enzym i díky tomu, že postačovala jednokroková purifikace na rozdíl od tříkrokového procesu purifikace z houbového média. Enzym byl charakterizován a jeho vlastnosti byly porovnány s ?-N-acetylhexosaminidasou z původního houbového producenta. Byl porovnán výtěžek a čistota enzymu, pH optimum, pH stabilita, teplotní optimum a kinetické parametry.

Abstract ?-N-Acetylhexosaminidase is an enzyme belonging to glycosidases, which hydrolyze glycosidic bonds in nature, but are able to synthesize it under suitable reaction conditions. ?-N-Acetylhexosaminidases from filamentous fungi are inducible extracellular enzymes. They are known for their physiological role in the chitinolytic system of the cells of growing fungi - they are responsible for controlling the lysis of chitin cell wall and regulate cell reconstitution. In biotechnology they have potential use in the synthesis of oligosacharides thanks to their good transglycosylation abilities. For recombinant expression of ?-N-acetylhexosaminidases from higher organisms, such as fungi and mold, it is advantageous to use yeast expression systems such as Pichia pastoris or Saccharomyces cerevisiae. The ?-N-acetylhexosaminidase from the fungus Penicillium oxalicum is an attractive enzyme for possible biotechnological application due to its high GalNAcase activity, wide substrate specificity and good pH stability. In this thesis, the ?-N-acetylhexosaminidase enzyme from Penicillium oxalicum was produced by recombinant expression in the expression system of the yeast of Pichia pastoris. The recombinant enzyme was produced in higher amount and purity than the original fungal enzyme - also because its one-step purification was sufficient to reach high purity in contrast to the three-step purification process from the fungal medium. The enzyme was characterized and its abilities were compared to the original fungal ?-N-acetylhexosaminidase concerning the yield and purity of enzyme, pH optimum, pH stability, temperature optimum and kinetic parameters.