Porovnání fluorescenčních spekter zdravých a nádorových buněčných kultur

Abstract

Bioflurescence je emise světla v UV, VIS a blízké IČ ve které emitují biologické materiály (buňky) při excitaci vhodnou vlnovou délkou. Přítomnost a vzájemné vazby biofluoroforů v živých organismech ovlivňují jejich emisní spektra a jsou tedy možným nástrojem ke studiu biologických materiálů. Mezi biofluorofory, obsaženém v buňce, patří NADH, který je důležitým prvkem v metabolismu buňky při tvorbě ATP. Proto byl vybrán jako indikátor pro porovnání spekter zdravé a nádorové buněčné kultury. V práci jsou porovnána emisní spektra zdravých 3T3 a nádorových CT26 buněk stejného typu. Excitační vlnové délky 260nm, 340nm a 365nm, shodné s absorpčními maximy NADH, byly použity pro experimenty. Buněčné kultury byly kultivovány standardně v DMEM (M.I. a M.II.) a pro měření připraveny jako suspenze v PBS s pH7 s definovanými koncentracemi 1,25E4 a 5E4 buněk/ml. Emisní spektra byla měřena na spektrofluorometr Fluoromax-4 v spektrálním rozsahu 380nm až 600nm. Naměřená spektra byla zpracována programem GASpeD, který umožnil rozložit spektrum na jednotlivé příspěvky od biofluoroforů obsažených v buňce v oblasti maximální emise NADH na 460 nm. Cílem práce bylo porovnat emisní spektra zdravých a nádorových buněk a tyto rozdíly využít k diagnostickým metodám. Výsledky porovnání spekter ukazují, že rozdíly jsou v intenzitě fluorescence a v některých případech i v posunu maxim u sledovaných vlnových délek. Na metabolické úrovni byl pozorován větší narůst intenzity fluorescence v oblasti kolem 460nm u nádorových, než u zdravých buněk, což je v souladu s literaturou. Je uvedena závislost intenzity fluorescence na vlnové délce 460 nm naměřené a určené pomocí GASpeD, na době ozařování vzorku CT26 s PpIX excitovaném na 350 nm. Závislost určená na základě GASpeD má odpovídající klesající tendenci, což odpovídá očekávání.

Bioflurescence is the emission of light in UV, VIS, and near IR emitted by biological materials (cells) at a suitable excitation wavelength. The presence and interrelation of biofluorophores in living organisms influences their emission spectra and is therefore a possible tool for the study of biological materials. Among the biofluorophores contained in the cell are NADH, which is an important element in cell metabolism in ATP production. Therefore, it was chosen as an indicator for the comparison of the spectrum of healthy and tumor cell culture. In this work the emission spectra of healthy 3T3 and tumor CT26 cells of the same type (fibroblasts) are compared. Excitation wavelengths of 260nm, 340nm and 365nm, identical to the NADH absorption maxima, were used for experiments. Cell lines were cultivated as standard in DMEM (M.I. and M.II.) and prepared as a suspension in PBS with pH7 at defined concentrations of 1.25E4 and 5E4 cells/ml. Emission spectra were measured on spectrofluorometer Fluoromax-4 in a spectral range of 380nm to 600nm. The measured spectra were processed by the GASpeD program, which allowed the spectrum to be decomposed to individual contributions from the biofluorophores contained in the cell in the area of NADH emission maximum 460nm. The aim of this work was to compare the emission spectra of healthy and tumor cells and use these differences for diagnostic methods. The results of the comparison spectra show that the differences are the fluorescence intensity and in some cases also the shift of emission maxima at the specific wavelengths. At the metabolic level, a greater increase in fluorescence intensity was observed in the area of wavelength around 460nm in the tumor than in healthy cells, which is consistent with the literature. The time dependence of fluorescence intensity at the wavelength of 460 nm of the carcinoma cells CT26,after applying PpIX and irradiated, at the excitation wavelength of 350 nm was shown from the measured data and the decomposition of GASpeD. Time dependence determined by GASpeD has shown the declining tendency, which corresponds to expectations.