Analýza struktury a pružnosti molekul kolagenu za různých podmínek za použití mikroskopie atomárních sil

Abstract

Kolagen je bílkovina s hierarchickou strukturou a je nutná k zajištění mechanické stability tkání v lidském těle. Existuje mnoho nemocí, které postihují kolagen na jeho různé úrovni. Pro studium kolagenu na jeho nejnižší úrovni, tedy úrovni kolagenních molekul, je možné použít mikroskopii atomárních sil, která dokáže zobrazit různé struktury až v měřítku nanometrů. V dnešní době je velké množství studií, které se zabývají kolagenem na úrovni vláken. Avšak mechanické vlastnosti kolagenních molekul zatím nejsou dobře popsány. Tato diplomová práce se zabývá flexibilitou kolagenních molekul ve vodném roztoku a roztoku Tris-HCl pufru. Ke studiu flexibility kolagenních molekul jsem využil persistentní délku, kterou jsem vypočítal z délky kontury a délky od konce ke konci molekul. Molekuly kolagenu byly usazené na plochém slídovém nosiči. Celkově v této práci bylo naskenováno a zpracováno kolem 60 snímků kolagenních molekul. Persistentní délka byla spočítána v Tris-HCl pufru (s přídavkem 10mM roztoku NaCl) a ve vodném roztoku. Hodnoty persistentní délky byly srovnány s hodnotami, které se uvádějí v literatuře. Persistentní délka kolagenních molekul v Tris-HCl pufru byla 199.9?12.8 nm a persistentní délka molekul ve vodném roztoku byla 11.5?2.5 nm. V pufru Tris-HCl jsme naměřili struktury, které vykazovaly vyšší délku kontury, než mají kolagenní molekuly. Tyto útvary se zdály být kolagenní dimery. Tyto dimery byly ve dvou formách (1D-staggered form, 2D-staggered form). Persistentní délka kolagenních dimerů u 1D-staggered form byla 155.3?26.0 nm a persistentní délka dimerů u 2D-staggered formy byla 185.7?38.0 nm.

Collagen is a fibril-forming protein that has a hierarchical structure and it is responsible for mechanical stability of body tissue. There are, however, many diseases which affect collagen at different hierarchical levels. Atomic force microscopy can be used for imaging collagen at the lowest level, the level of collagen molecules. It can image structures on the nanometer scale. However, there have been many studies performed at the level of collagen fibrils, the mechanical properties of collagen at the molecular scale are not well established. This master thesis aims to determine the flexibility of the collagen molecules in water Milli-Q? and in Tris-HCl buffer. The persistence length is a measure of the flexibility of molecule. The persistence length of rat tail type I collagen was extracted from the contour length and end-to-end distance of the molecules. The collagen molecules were deposited onto two-dimensional surface of mica substrate. We scanned and processed about 60 AFM height images of collagen molecules. Persistence length was calculated in Tris-HCl buffer (supplemented with 10mM NaCl) and Milli-Q? water, and compared to values which were in the literature. The persistence length of collagen molecules in Tris-HCl buffer was 199.9?12. 8 nm and the persistence length of molecules in Milli-Q? water was 11.5?2.5 nm. In Tris-HCl buffer we determined structures which had higher contour length than collagen molecules and seemed to be collagen dimers. These dimers were in 1D- and 2D-staggered form. The persistence length of collagen dimers in 1D-staggered form was 155.3?26.0 nm and the persistence length of dimers in 2D-staggered form was 185.7?38.0 nm.