Sledování RNA interference pomocí luminiscenčních nanočástic

Abstract

Mikro-RNA (miRNA) jsou malé nekódující molekuly, které jsou důležité pro regulaci buněčných funkcí. Deregulace hladiny určitých miRNA může být faktor přispívající ke vzniku nádoru, proto je v dnešní době zvažována genová terapie pomocí modulace hladiny miRNA. Bylo prokázáno, že hladina miRNA-135b je u pacientů s rakovinou tlustého třeba zvýšená. Antagomir-135b je molekula snižující hladinu miRNA-135b vzájemnou komple- mentaritou. Cílem této práce je monitorování RNA interference pomocí systému nanodia- mantu s navázanou molekulou Antagomir-135b, dopraveného do nádorových buněk. Je dokázáno, že nanodiamanty s povrchovouúpravou PEI jsouúčinný transfekční a moni- torovací systém. Molekuly miRNA jsou navázány na nanodiamanty pokryté PEI, poté jsou dopraveny do buněčné linie nádoru slepého střeva in vitro a pozorovány v konfokálním mikroskopu. Poté je zjištěna míra RNA interference za použití PCR v reálném čase. Vzh- ledem k rozdílné expresi miR-135b u lidského a myšího modelu byl pro následné aplikace použit systém s miRNA-1, která reguluje expresi cílového genu Twinfilin-1. Komplex nan- odiamantu s miRNA-1 je intraperitoneálně injikován do Balb/c myšího modelu, z něhož je z vybraných buněk izolována RNA a detekována míra exprese pro Twinfilin-1. Je ověřenúčinek komplexu nanodiamantu s miRNA-1 na buňky, které by mohly akumulovat nan- odiamanty a tím přispívat k orgánové toxicitě.

Micro-RNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules, which are important regula- tion of cell functions. Deregulation of certain miRNA level is contributing factor of tumor formation and progression. Possible gene therapy by modulation of the miRNA level is currently considered. It has been proved that the level of miRNA-135b in patients with colorectal cancer is increased. Antagomir-135b is a molecule reducing the level of miRNA- 135b via mutual complementarity. The aim of this thesis is monitoring of RNA interference using nanodiamond system with linked antagomir-135b, which is delivered to the tumor cells. It has been proved that nanodiamonds coated with PEI are efficient transfection and monitoring system. MiRNA molecules are bound to the PEI coated nanodiamonds, then transported into the colon cancer cell line in vitro and observed in a confocal micro- scope. The level of RNA interference is detected via real-time PCR. Due to the different expression of miRNA-135b in human and mouse model, we used the system with miRNA- 1, which regulates gene expression of Twinfilin-1. Nanodiamond complex with miRNA-1 is injected intraperitoneally into Balb/c mouse model, RNA is isolated from selected cells and the expression level of Twinfilin-1 is detected. The effect of nanodiamond complex with miRNA-1 is verified within cells, which could accumulate nanodiamonds and thus contribute to organ toxicity