Metody genetického inženýrství pro genetickou a funkční analýzu genů modifikujících odpověď k parazitu Leishmania major

Abstract

Tato diplomová práce analyzuje metody genetického inženýrství využívaných pro genetickou a funkční analýzu genů, které modifikují odpověď kparazitu Leishmaniamajor. První část popisuje základní metody genetického mapování obecně a ukazuje jejich aplikace vbiomedicínském inženýrství. Další část představuje přístroje nezbytné pro úspěšné použití popisovaných technik. Druhá část demonstruje zvládnutí významnýchtechnik genetického inženýrství: izolaci DNA, PCR, syntézu cDNA, PCR vreálném čase, a praktické použití těchto metod pro mapování genů a analýzu exprese vybraných genů. Tovedlo kmapování tří lokusů, kterékontrolují odpověď kL. majoru F2křížencůmezi kmeny O20 a OcB-43, a ke stanovení exprese těchto genů: Synaptotagmin 14 (Syt14), Fc receptor, IgG, low affinity 4 (Fcgr4), Guanylate binding protein 1 (Gbp1) and Guanylate binding protein 5 (Gbp5) v kůži neinfikovaných a infikovaných myší deseti myších kmenů. Diskuze porovnává výhody a nevýhody dvou termocyklerů (DNA Engine Dyad? Peltier Thermal Cycler, iCycler iQ? Real-Time PCR Detection System) a poskytuje strategiipro výběr nejvhodnějšího přístroje adekvátního pro potřeby určité metody založené n a PCR. Vdruhé části diskuze popisuji znaky nově identifikovaných vnímavých lokusů a ukazuji důležitý vliv genetických interakcí na expresi genů Syt14, Fcgr4, Gbp1a Gbp5

This diploma thesis analyzes methods of genetic engineering for genetic and functional analysis of genes that modify response to parasite Leishmania major. First part describes basic methods of genetic mapping in general and shows their applications in biomedical engineering. Next section introduces devices indispensable for successful use of the described techniques. Second part demonstrates mastering of the important techniques of genetic engineering: DNA extraction, PCR, cDNA synthesis, real-time PCR, and practical use of these techniques for gene mapping and analysis of expression of selected genes. This led to mapping of three loci that control response to L. majorin F2hybrids between strains O20 and OcB-43, and to establishment of expression of genes Synaptotagmin 14 (Syt14), Fc receptor, IgG, low affinity 4 (Fcgr4), Guanylate binding protein 1 (Gbp1) and Guanylate binding protein 5 (Gbp5) in skin of uninfected and infected mice of in ten mouse strains. Discussion compares advantages and disadvantages of two thermal cyclers ( DNA Engine Dyad? Peltier Thermal Cycler, iCycler iQ? Real-Time PCR Detection System) and gives a strategy for choosing the most appropriate thermal cycler suitable for the needs of a particular PCR-based method. In the second part of Discussion I describe features of newly identified susceptibility loci and show important influence of gene interactions on gene expression of Syt14, Fcgr4, Gbp1and Gbp5.