Příprava kongenních myší nesoucích definované genomické konstrukty

Abstract

Leihsmanie jsou prvoci přenášení vektory, kteří způsobují nemoc zvanou Leishmaniáza. Je známo asi 21 druhů tohoto prvoka, které dokáží nakazit člověka. Leishmaniáza se rozděluje dle jejích klinických projevů na 3 formy, a to kožní, mukokutánní a viscerální. Z hlediska světové problematiky to je jedna z nejvíce opomíjených onemocnění a její léčba je velice zdlouhavá a náročná, leckdy nemožná, jelikož přímý lék neexistuje. Velmi malé změny v genetickém pozadí hostitele dokáží změnit průběh nákazy a projevu nemoci. Porozumění nemoci a nalezení genů, které zajišťují různorodé klinické projevy, se stalo předmětem bádáním vědců. Tyto znalosti se následně dají uplatnit v předcházení nemoci a v efektivnosti léčby. Tato práce popisuje strategie pro přípravu myší a metody, které se k tomu v molekulárně biologických laboratoří využívají. Cílem práce je připravit myši nesoucí přesně definované genomické konstrukty, aby se následně dali zjistit geny, které by mohly mít vliv na průběh nemoci. Teoretická část popisuje techniky používané při tvorbě myších kmenů a principy metod, které se při jejich definování využívají. Experimentální část pojednává o metodách používaných při typizaci genomu, na jejímž základě se vybírají myši pro další křížení. Dle výsledků byla u FMC (jemně mozaikový chromozom) strategie nalezena myš, která měla rekombinaci na požadovaném lokusu Lmr 5 (Leishmania major response), ale další části genomu obsahovaly úseky původu STS. Následně byla zpětným křížením přečištěna tak, že osahovala krátký segment původu STS pouze v požadovaném úseku, zatímco ostatní genom byl původu BALB/c. U standardní tvorby rekombinantů, byl typizován kmen 6354/XJ, a dle něj vytvořena mapa, která bude sloužit pro další křížení. S pomocí těchto map se po dalších experimentech může, zkrátit lokus lmr 5, který je přesně zodpovědný za fenotypické změny v průběhu nemoci a následně se můžou určit geny, které jsou za to přímo zodpovědné.

Leishmania are protozoa transmitted by a vector that cause disease called Leishmaniasis. There are around 21 species of this protozoa that can infect humans. Leishmaniasis is divided according to its clinical manifestations into 3 forms: cutaneous, mucocutaneous and visceral. In terms of worldwide problems, it is one of the most neglected diseases and its treatment is very lengthy and difficult, sometimes impossible, because there is no direct cure. Even small changes in the genetic background of the host can influence the course of infection and the manifestation of the disease. The need for better understanding of this disease and finding the genes that influence the diverse clinical manifestations became the subject of scientific exploration. This knowledge can then be applied to prevent the disease and to enhance the effectiveness of the treatment. This work describes a strategy for the preparation of mice and methods that are utilised for this purpose in the molecular biology laboratories. The objective of this work is to prepare mice carrying a precisely defined genomic constructs that subsequently allow for detection of the genes that could affect the manifestation of the disease. The theoretical part describes the techniques used in preparing strains of mice and principles and methods that are used for their characterisation. Experimental part describes the methods used for the genotypisation that is then utilised in the selection for further breeding. Mice found by FMC (fine mosaic chromosome) strategy had the recombination at the desired locus Lmr 5 (Leishmania major response), but other parts of the genome contained stretches of original STS. Subsequently, the genetic make-up of the above mentioned mice was purified by backcrossing so that it contains a short segment of original STS only in the desired region, while the other part of the genome was of the BALB/c origin. In a standard recombinants crossings was typified the strain 6354/XJ, and was created a map that will be used for further breeding. Using these maps, further experiments may shorten the size of the locus Lmr 5 that is responsible for the phenotypic changes during the course of the disease, and consequently it will be possible to identify the specific genes directly responsible for these changes.