Analýza myších kmenů lišících se ve vnímavosti k Leishmania major

Abstract

Tato práce je zaměřena na laboratorní metody využívané ve výzkumu k objasnění patogeneze působení prvoky rodu Leishmania a mechanismus jejich účinku na imunitní odpověď organismu hostitele. V závislosti na druhu Leishmania existují tři hlavní typy projevu onemocnění: kožní, kožně - slizniční a viscerální. Každý organismus je individualita, která má se svým druhem společnou převážnou část genomu, ale v některých úsecích DNA se navzájem liší, proto každý jedinec odpovídá na nákazu patogenem jiným způsobem. Tyto predispozice k rozšíření nebo potlačení patogenu v organismu jsou řízeny více geny malého účinku a předurčují náchylnost jedince k propuknutí nebo potlačení choroby. Protože heterogenita odpovědi lidského hostitele je kvůli působení různých životních podmínek značná, nejlepší způsob, jak prozkoumat vliv těchto genů s malou penetrancí, je studovat jejich účinky na modelových zvířecích organismech, například myších, jejichž genom byl sekvenován. Možnost specifického účelného křížení myších kmenů nám umožňuje odhalit geny, které ovlivňují různé imunologické aspekty odpovědi organismu k dané infekci. Vzhledem k ortologii těchto genů přítomných v lidském genomu lze předpovědět u člověka možný fenotypový projev indukovaný infekcí a míru imunitní obrany proti patogenu. K tomuto účelu jsme použili modely rekombinantních kongenních kmenů (RCS) myší CcS/Dem odvozených od inbredního myšího kmene BALB/c, který je k infekci citlivý, a rezistentního myšího kmene STS. Křížením bylo získáno 20 kmenů, ze kterých každý obsahuje náhodných 12,5 % genomu dárcovského kmene STS na pozadí 87,5 % genomu BALB/c. Tímto způsobem se podařilo rozdělit geny odolnosti kmene STS mezi jednotlivé RCS. Tyto kmeny jsme pak fenotypicky otestovali a kmeny, které byly nejodolnější (a tedy obsahovaly geny odolnosti) a nejvnímavější jsme vybrali k další analýze. Postupně jsme připravili F2 hybridy mezi kmenem BALB/c a kmeny CcS-5, CcS-9, CcS-11, CcS-16 a CcS-20 a mapovali jsme v nich 23 lokusů Lmr (Leishmania major response). Mým úkolem bylo přesné mapování lokusu Lmr5, který se nachází na distální části 10. chromosomu. Rekombinantním mapováním byla zúžena oblast, kontrolující hladinu IgE v séru a velikost kožních lézí, na 5 Mbp. Bioinformatickou analýzou byl v této oblasti detekován kandidátní gen. Během své bakalářské práce jsem se podílela na přípravě dvou rekombinantních kmenů o délce 1.5 Mbp a 1 Mbp, které umožní potvrzení tohoto kandidátního genu.

This bachelor thesis is focused on elucidation of the way how protozoan parasite of Leishmania family have pathogenic effect on the host and so to clarify the mechanisms of this impact on immunity system of his organism. According to which species are involved, three types of disease are distinguished : cutaneous, muco- cutaneous and visceral form. Although each organism has most of its genome similar to its species, still there are some parts of DNA in which the individual differs to each other. This is the reason why every individuality responses to this disease differently. Symptoms of disease caused by this pathogens are affected by multiple genes, which determine the phenotype effect. According to heterogeneity of human population and differences in lifestyle and time exposure to infections, the best way how to explore these low-penetrance genes is to study them using the model organisms. Because the mouse genome was sequnced, efficient crossing of mouse strains can help us to identify genes involved in the host response to this infection. Orthologues of these genes in human genome then refer to potential rate of host's immunity system answer. For this case we used the model of recombinant congenic strains (RCS) CcS/Dem mouses, which consist from two inbred strains - susceptible BALB/c and resistant STS. Each of the 20 CcS/Dem RC mouse strain carries different random subset of 12,5 % genes of the resistant donor strain STS on the background of susceptible strain BALB/c. Genes of resistant STS strain were distributed among different RC strains and from these we choose the most susceptible and the most resistant RCS to further analysis. We prepared F2 generation of the strains CcS-5, CcS-9, CcS-11, CcS-16 and CcS-20 crossed with BALB/c and mapped 23 Leishmania major response locus - Lmr. My objective was to map the Lmr5 on distal part of the chromosome 10. Thanks to recombinant mapping we narrowed the area which has influence in the size of the skin lesions and amount of IgE in serum to 5 Mbp and subsequent bioinformatic analysis detected the candidate gene. As the work for this bachelor thesis I participated on construction of two recombinant strains 1,5 and 1 Mbp long, which could confirm impact of this candidate gene.