Studium vlivu dvojmocných kationtů na lokální stabilitu DNAmetodami jaderné magnetické rezonance

Abstract

Diplomová práce se zabývá změnami v NMR spektrech DNA duplexů vyvolaných přítomností hořčíku. Cílem práce bylo zjistit, zda jsou tyto změny závislé na pozici báze v duplexu, bázové sekvenci a jak závisejí na teplotě. Tyto údaje jsou významné pro určení případných preferenčních vazebných míst v DNA duplexu a pro objasnění mechanismu této interakce. K vypracování diplomové práce bylo nezbytné si osvojit metody měření NMR spekter vysokého rozlišení ve vodných roztocích a optimalizovat podmínky měření. Byly změřeny teplotní závislosti 1H a 31P NMR spekter vysokého rozlišení vodných roztoků dvou palindromatických sekvencí DNA oktamerů při třech různých koncentracích. Chemické posuny aromatických protonů bází a fosforových jader fosfátových skupin byly analyzovány s ohledem na jejich závislost na teplotě a koncentraci hořčíku. Byly dále porovnávány s převzatými daty pro stejné oligonukleotidy v roztoku bez dvojmocných kationtů. Bylo zjištěno, že přídavek hořečnatých iontů v koncentracích 10-2 až 10-3 M do rozpouštědla obsahujícího řádově 200 mM koncentraci sodíkových iontů vyvolává dobře měřitelné změny chemického posuvu čar aromatických protonů bází i jader fosforu ve fosfátových skupinách. V případě aromatických protonů je největší vliv přítomnosti hořčíku v teplotní oblasti, kdy jsou oligonukleotidy ve formě stabilních duplexů, a s klesající teplotou se zvýrazňuje. Vyvolané změny chemického posunu jsou obojího znaménka a jsou souhlasné vždy pro několik nejbližších bází. Je viditelná tendence vyššího účinku na GC páry, ale lokální efekt hořčíku je dán konkrétní bázovou sekvencí. V případě NMR čar fosforových jader jsou změny chemického posunu vyvolané přítomností hořčíku větší, jejich velikost však na rozdíl od aromatických protonů bází roste s rostoucí teplotou. Dosažené výsledky ukazují jak na existenci specifické vazby hořčíku, tak na elektrostatickou nespecifickou interakci, které zřejmě existují souběžně. Zvyšováním teploty se více preferuje nespecifická interakce na úkor těsnější specifické vazby. Je tedy zřejmé, že při charakterizaci interakce hořčíku s DNA duplexem hraje významnou úlohu nejen bázové složení a koncentrační poměry, ale zásadní význam má i teplota.

The diploma thesis deals with the changes in NMR spectra of DNA duplexes induced by the presence of magnesium. The aim was to find out whether the changes depend on the base position in the duplex and the base sequence, and how they are influenced by temperature. This knowledge is important for determination of possible preferential binding sites in DNA duplex and explanation of the interaction mechanism. To carry out the objectives of the diploma work, it was necessary to learn the technique of high resolution NMR spectral measurement of aqueous solutions and to optimize experimental conditions. Temperature dependent high-resolution 1H and 31P NMR spectra of two palindrome DNA octamers were measured in three aqueous solutions with various magnesium contents. Chemical shifts of the aromatic base protons and of the phosphate-groups phosphorus 31P nuclei were analyzed in respect to their dependences on temperature and magnesium concentration. The results were compared with those available for the same oligonucleotides in solutions without divalent cations. It was revealed that addition of magnesium ions in 10-2 - 10-3 M concentration to the solvent containing about 200 mM of sodium ions brought about well measurable chemical-shift changes of both aromatic base protons and phosphorus nuclei in phosphate groups. In the case of aromatic protons, the main magnesium effect was in the temperature range where the oligonucleotides formed stable duplexes, being more pronounced with decreased temperature. The induced chemical-shift changes were positive and negative as well and were always similar for several neighbor bases. The tendency to higher impact on GC base-pairs was apparent, the local magnesium effect was though controlled by the particular base sequence. For NMR lines of the phosphorus nuclei, the magnesium-induced changes of the chemical shift are larger; their size, however, was increasing with increased temperature in contrast to aromatic protons. The results indicate the existence, probably simultaneous, of both the specific magnesium binding and the nonspecific electrostatic magnesium interaction. An increase of temperature supports the nonspecific interaction at the expense of the tight specific binding. It is thus obvious that not only the base composition and the concentration conditions but also the temperature plays a key role in the dominant mode of the magnesium interaction with DNA duplex.