Studium interakce funkcionalizovaných nanočástic diamantu s buňkami metodami fluorescenční mikroskopie

Abstract

Diamantové nanočástice jsou slibným materiálem pro potencionální využití v biomedicíně. Pro většinu aplikací, jako jsou vizualizace buněčných procesů, cílený přenos léčiv nebo genová terapie, je klíčové chování nanočástic v interakci s buňkou. Tato práce využívá stabilní fluorescence N-V center a její charakteristické doby dohasínání pro vizualizaci diamantových nanočástic pomocí metod fluorescenční konfokální mikroskopie (FLIM- fluorescence lifetime imaging, standartní měření) a následné posouzení účinnosti jejich průniku do buněk. V experimentu byly použity nanočástice s různou povrchovou funkcionalizací (s oxidovaným povrchem, s navázaným PEI2000/750000 a PEI2000/750000-DNA) a tři typy buněk: CT26, 3T3 a IC-21. Pro co nejpřesnější posouzení lokalizace nanočástic metodou FLIM byl každý vzorek skenován ve třech fokálních rovinách. Za účelem hrubého přehledu o chování nanočástic v buněčném vzorku byly následně pořízeny snímky o větším rozsahu pomocí klasického fluorescenčního konfokálního mikroskopu. Pro porovnání byla u buněk CT26 provedena analýza transfekční účinnosti pomocí průtokové cytometrie. Každá z použitých metod má své výhody a nevýhody, avšak žádná z nich neposkytuje zcela přesnou informaci o procentuálním zastoupení buněk s internalizovanými nanočásticemi. Z experimentů vyplývá, že navázání polymeru ovlivňuje internalizaci částic jen ve velmi malé míře (pro buněčné linie CT26 a 3T3 byly pozorovány nejlepší výsledky u komplexů ND-PEI750000). Všeobecně lze říci, že u komplexů s PEI a především s PEI-DNA dochází k nežádoucí agregaci, která má na účinnost průniku do značné míry vliv. Z toho důvodu nelze vliv navázaného polymeru jednoznačně prokázat. Dle očekávání byly nanočástice nejefektivněji pohlcovány fagocytujícímu buňkami IC-21.

Diamond nanoparticles are one of the promising materials to be used in biomedicine. The key aspect of nanoparticles that is important in most applications such as visualization of cellular processes, targeted drug delivery or gene therapy, is their behaviour when interacting with the cells. This thesis uses the nanoparticles? N-V centres fluorescence stability and the fluorescence decay time of these centres for nanodiamond visualization in the sense of fluorescence confocal microscopy (FLIM - fluorescence lifetime imaging, standart measurement) for evaluating the goodness of diamond nanoparticles penetration into the cells. Nanoparticles with different surface modification (surface oxidation, modification with PEI2000/750000 or PEI2000/750000-DNA) and three cell types (CT26, 3T3 and IC-21) were used for experimental measurement. Transfection efficiency analysis by flow cytometry measurement was performed for CT26 cells. Three different focal planes were scanned by FLIM method for each sample to precise determination of the nanoparticles? localization. Conventional fluorescence confocal microscopy was used to determine nanoparticles general behaviour in the cell samples by images in wide range. Transfection efficiency analysis by flow cytometry measurement was performed for CT26 cells Each method used for nanoparticles visualization has its benefits and disadvantages and none of these provides precise quantitative information of the efficiency of nanoparticles uptake to the cells. From experimental measurements can be seen that surface modification by polymer PEI influences the intemalization minimally (CT26 and 3T3 cell lines revealed the best results with the complexes of ND-PEI750000). PEI complexes in general and PEI-DNA complexes in particular occurs undesirable aggregation that has an impact to the efficiency uptake in great extent. For this reason the impact of PEI surface modification on the nanodiamonds uptake efficiency cannot be positively concluded.Highest efficiency uptake of nanodiamond particles was performed by phagocytic IC-21 cells as it was expected.