Rekonstrukce snímků buněk pořízených pomocí mikroskopie se strukturovaným osvětlením

Abstract

Super-resolution (SR) is a powerful imaging approach which offers significant gains in both lateral and axial resolution far beyond the diffraction limit of standard wide-field microscopy. This has lead to numer-ous breakthroughs in biology during the past 50 years of its existence. Among SR methods, structured illumination microscopy (SIM) has an major advantage with its flexibility of implementation and photon-efficiency due to which it plays a lead role in high-frequency in vivo cell acquisitions. First the elementary physics necessary for determining the transfer of light through an microscope is given by the derivation of the electro-magnetic (EM) field wave equation along with two of its most significant solutions for the application of microscopy optics. Next an condensed but informative overview of available SR methods is presented with the focus on comparing their utility in biological sensing applications. Intuitive conception behind the functioning of SIM is illustrated before the mathematical presentation of the fundamentals of harmonic SIM. An enumeration of examples where SIM is used in combination with other microscopy modalities and in various implementations demonstrates the flexibility the technique. Then an analysis of micro-beads images from a harmonic SIM acquisition is performed with the goal of enhancing the reconstruction. Two different methods of reconstruction are derived, implemented and demonstrated in multiple variations. The ability of limiting the number of acquisitions necessary for the reconstruction is discussed and shown alongside a commentary of further aspects, benefits and drawbacks of the reconstruction techniques. Further enhancements to the reconstruction techniques in the reduction of artefacts and improvement of visual quality and resolution is achieved by performing them with an estimated transfer function of the optical system. The estimation is performed using various procedures utilizing the model of the source structure in the object space of the determined by a custom novel algorithm inspired by multiple digital image processing algorithms. The fidelity over the SIM imaging technique currently used for the reconstruction of endocytosis at the cell membrane surface is attained by the data-driven transfer function estimate.

Super-rozlišení (SR) je výkonná metoda pro pozorování, která nabízí významné zlepšení rozlišení jak v laterálním, tak axiálním směru dosahující daleko za difrakční limit standardního světelného mikroskopu. To vedlo k mnoha významným objevům v biologii během posledních 50-ti let od vzniku prvních metod SR. Mezi metody SR má mikroskopie se strukturovaným osvětlením (SIM) důležitou výhodu ve své flexibilitě implementace a fotonové efektivitě, díky které hraje vedoucí roli v akvizici živých buněk s vysokou frekvencí snímků. Nejprve jsou prezentovány základní fyzikální principy nutné pro určení přenosu světla optickým mikroskopem, v podobě odvození vlnové rovnice pro elektro-magnetické (EM) pole spolu s jejími dvěma řešeními nejvýznamnějšími pro aplikaci v optice mikroskopu. Dále je představen přehled dostupných metod SR se zaměřením na srovnání jejich užití v biologických pozorováních. Intuitivní pojetí fungování mikroskopie se strukturovaným osvětlením je ilustrováno a následně matematicky představena podstata při harmonickém osvětlení. Pomocí přehledu příkladů využití SIMu v kombinaci s dalšími modalitami mikroskopie a v různých implementacích demonstruji flexibilitu této metody SR. Poté je provedena analýza pozorování mikrokuliček z akvizice pomocí harmonického osvětlení s cílem vylepšit kvalitu rekonstrukce. Jsou odvozeny, implementovány a demonstrovány dvě různé metody rekonstrukce v několika variantách. Schopnost omezit počet akvizicí potřebných pro rekonstrukci je diskutována a ukázána spolu s komentářem k dalším aspektům, výhodám a nevýhodám rekonstrukčních technik, které byly i nebyly použity. Další zlepšení rekonstrukčních metod snižováním přítomnosti artefaktů a zlepšováním vizuální kvality a rozlišení je dosaženo rekonstrukcí s odhadovanou přenosovou funkcí optického systému. Odhad je proveden pomocí různých postupů využívajících model struktury vzorku, který určen vlastním novým algoritmem inspirovaným zavedenými metodami digitálního zpracování obrazu. Zvýšená věrnost rekonstrukce akvizice nad aktuálně používanou metodou pro rekonstrukci endocytózy na povrchu buněčné membrány je dosažena odhadem přenosové funkce řízené přímo daty z akvizice samotné.