Development of Active Part of Optical Fiber Biosensor Using Genetically Modified Organisms

Abstract

Využití optických vlastností geneticky modifikovaného organismu (GMO) Pseudomonas putida TVA8, který je schopen produkovat bioluminiscenci (λ≈500nm) ve styku s benzenem, toluenem, etylbenzenem a xyleny, je jedním z možných principů optických biosenzorů detekujících tyto nebezpečné látky a další analyty. S využitím fyzikálně-chemických modelů buněčných interakcí s pevnými povrchy je poukázána snadnější adsorpce buněk P. putida TVA8 na křemenný povrch po ošetření γ-aminopropyltriethoxysilanem (APTES), bez použití nestabilní chemické matrice. Je demonstrována imobilizace mikroorganismů ve formě biofilmu na optovláknový element (OVE), který byl navržený pro zesílení slabého bioluminiscenčního signálu, čímž byl získán nejméně 135 dní aktivní optický prvek schopný on-line detekce přítomnosti toluenu v médiu (26,5 mg L-1) a reálného vzorku odpadní vody. Opakovatelnost přípravy sondy OVE a její použití bylo prokázáno s pěti OVE různých geometrií. Byly otestovány také další mikroorganismy, konkrétně E. coli 652T7, S. cerevisiae BLYR a P. fluorescens HK44 citlivé na různé analyty a jejich biologickou toxicitu. Intenzita měřené bioluminiscence byla ovlivněna OVE s transmitancí mezi 1,4 a 5 %. Je popsán ideální tvar a geometrii OVE včetně porovnání bioluminiscenční odpovědi pěti OVE s různými geometriemi. Intenzita detekované bioluminiscence pomocí OVE byla několikrát větší než u PCS optického vlákna. Intenzity bioluminiscence se postupně snižovaly v důsledku uvolňování adsorbovaných buněk; a byly nižší, když byly indukovány kontaminovanou podzemní vodou, než v minerálním médiu (MSM) se stejným obsahem toluenu. Koncentrace toluenu 26,5 mgL-1 byla detekována do 30 minut po ponoření sondy do vzorku. Imobilizace dalších mikrobiálních kmenů na povrchu křemičitého skla, funkcionalizovaného APTES, byla neúspěšná a je třeba zvážit další imobilizační techniky – i.e. prokázanou imobilizaci E. coli 652T7 pomocí polyethyleniminu. Prvek je použitelný jako detekční sonda pro vícenásobné použití v laboratoři a online monitorování biologicky dostupné kontaminace ve vzdálených lokalitách. Prezentované experimenty byly realizovány v laboratoři Ústavu chemických procesů AV ČR v Praze-Suchdole a v laboratoři partnerského centra pro environmentální biotechnologie na University of Tennessee v americkém Knoxville.

The use of optical properties of the genetically modified organism (GMO) Pseudomonas putida TVA8, which is capable of producing bioluminescence (λ≈500nm) in contact with benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes, is one of possible principles of optical biosensors detecting hazardous and other analytes. Facilitation of adsorption of P. putida TVA8 cells on quartz surface, after its treatment with γ-aminopropyltriethoxysilane (APTES), without the use of an unstable chemical matrix, is presented with the use of physico–chemical models of interactions of cells with solid surfaces. Immobilization of microorganisms in the form of biofilm on the optical fiber element (OFE), designed to amplify week bioluminescent signal, was demonstrated and an active optical element capable of on-line detection of the presence of toluene in the medium (26.5 mg L-1) and a real sample of wastewater for at least 135 days was obtained. Repeatability of preparation of OFE probe and its use was demonstrated with five OFEs of different geometries. Other microorganisms, namely E. coli 652T7, S. cerevisiae BLYR, and P. fluorescens HK44 sensitive to different analytes and their biological toxicity were also tested. The intensity of measured bioluminescence was influenced by shapes of OFEs possessing transmittances between 1.4 and 5 %. The ideal shape and geometry of an OFE was described and compared to the real bioluminescence responses of five OFEs with different geometries. Intensity of detected bioluminescence with OFE was several times greater than with an PCS optical fiber. The intensities of bioluminescence gradually decreased due to release of the adsorbed cells; and were lower when induced with contaminated ground water than in the mineral medium (MSM) with the same content of toluene. Toluene concentration 26.5 mgL-1 was detected within 30 minutes of immersion of the probe into a sample. Immobilization of other microbial strains on APTES functionalized silica glass surface was unsuccessful, other immobilization techniques needed to be considered - i.e. demonstrated immobilization of E. coli 652T7 using polyethyleneimine. The element is conceivable as a detection probe for multiple use in a laboratory and the online monitoring of bioavailable contamination in remote localities. Presented experiments were carried on in laboratory of the Institute of Chemical Process Fundamentals of the Czech Academy of Sciences in Praha-Suchdol and at laboratory of the partner Center for Environmental Biotechnology of the University of Tennessee in Knoxville, USA.