Dynamická kultivace kmenových buněk na titanových matricích

Abstract

Mnoho traumatických i netraumatických poškození kostí vyžaduje léčbu pomocí kostních náhrad nebo štěpů, dle rozsahu defektu a ztráty objemu kosti. Nejčastěji používaným materiálem pro kostní implantáty jsou slitiny titanu, konkrétně Ti6Al4V, vzhledem k jejich síle v tahu, široké využitelnosti, vysoké odolnosti vůči korozi a biokompatibilitě. Modifikace topografie a morfologie povrchu implantátů navíc zlepšuje jeho osteointegraci. I přes to se však vyskytují časté komplikace – infekce, záněty, nedostatečná osteointegrace implantátu, aseptické uvolnění, které vyžadují reoperaci implantátu. Východiskem z tohoto problému může být kolonizace povrchu implantátu autologními buňkami pacienta a implantace modifikované náhrady. Cílem práce je kolonizovat modelovou titanovou matrici kmenovými buňkami, diferencovanými do osteoblastů, s využitím dynamické kultivace, která simuluje fyziologické podmínky organismu a přispívá k rychlejší osteogenezi. Práce je rozdělena na tři části. První část práce popisuje návrh systému pro dynamickou kultivaci buněk za fyziologických podmínek, jež stimuluje osteogenní buněčnou diferenciaci tlakovým namáháním. Součástí systému je přepínač pro 4 skupiny komor, který automaticky řídí stimulaci každé skupiny unikátními parametry tlaku. Systém je doplněn o dva typy komor – pro testování substrátů a matric a pro kultivaci více vzorků pomocí standardních kultivačních desek. V další části práce jsou testovány Ti6Al4V substráty s různými povrchovými úpravami (leštění, tryskání, kartáčování, anodizace a pokrytí uhlíkem podobným diamantu) z hlediska jejich vlivu na proliferaci a osteogenní diferenciaci mezenchymálních kmenových buněk izolovaných z tukové tkáně. Na základě buněčných experimentů byl zvolen anodizovaný substrát, neboť bylo zjištěno, že substráty s drsností v řádu několika desítek nanometrů nejvíce podporují osteogenezi i proliferaci buněk. Anodizovaný povrch byl nakonec osazen kulturou kmenových buněk, přičemž část vzorků byla pokryta fibrinovými gely o koncentraci fibrinu 1 a 5 mg/ml, v němž byly buňky inkorporovány. Vzorky byly kultivovány 7 dní za působení pulsatilního tlaku (0/40 kPa, 0,5 Hz po dobu 1 hod./den). U dynamických kultur byla zvýšená exprese osteogenních markerů ve srovnání se statickými kulturami, buňky v gelu o koncentraci fibrinu 5 mg/ml byly navíc orientovány paralelně se siločarami tlakového namáhání, podobně jako ve fyziologickém prostředí. Nejvyšší osteogeneze bylo dosaženo v gelu s 5 mg/ml fibrinu, avšak proliferace byla nižší, než u 1 mg/ml. Osteogenní diferenciace dynamických 2D vzorků byla několikanásobně vyšší, než u statických kultur. Bylo tedy prokázáno, že použití gelů o koncentraci fibrinu 5 mg/ml, případně přímo násada buněk na substrát bez gelu, je optimální pro kolonizaci titanového povrchu. Výsledky dizertační práce mohou přispět ke zlepšení osteointegrace titanových implantátů.

Many traumatic and non-traumatic bone injuries require treatment with bone replacements or grafts, depending on the extent of the defect and the loss of bone volume. The most commonly used material for bone implants are titanium alloys, specifically Ti6Al4V, due to their tensile strength, wide applicability, high corrosion resistance and biocompatibility. In addition, modification of the topography and morphology of the implant surface improves its osteointegration. Nevertheless, there are frequent complications - infection, inflammation, insufficient osseointegration of the implant, aseptic loosening, which require reoperation of the implant. The starting point for this problem may be the colonization of the implant surface by the patient's autologous cells and the implantation of a modified prosthesis. The aim of this work is to colonize the model titanium matrix with stem cells differentiated into osteoblasts using dynamic cultivation, which simulates the physiological conditions of the organism and contributes to faster osteogenesis. The work is thus divided into three parts. First, a system for dynamic cell culture under physiological conditions was designed, which stimulates osteogenic cell differentiation by compressive stress. The system includes a switch for 4 groups of chambers, which automatically controls the stimulation of each group with unique pressure parameters. The system is supplemented by two types of chambers - for testing substrates and for culturing multiple samples using standard culture plates. In the next part of the work, Ti6Al4V substrates with various surface treatments (polishing, blasting, brushing, anodization and diamond-like carbon coating) are tested in terms of their effect on proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Based on cell experiments, an anodized substrate was chosen, as it was found that substrates with a roughness in the order of several tens of nm most support osteogenesis and cell proliferation. The anodized surface was finally seeded with a stem cell culture, and some of the samples were covered with fibrin gels at fibrin concentrations of 1 and 5 mg/ml, in which the cells were incorporated. Samples were cultured for 7 days under pulsatile pressure (0/40 kPa, 0.5 Hz for 1 hour/day). In dynamic cultures, the expression of osteogenic markers was increased compared to static cultures, and the cells in the gel with a fibrin concentration of 5 mg/ml were, in addition, oriented against the direction of compressive stress, similar to the physiological environment. The highest osteogenesis was achieved in the 5 mg/ml fibrin gel, but the proliferation was lower than in 1 mg/ml gel. Osteogenic differentiation of dynamic gel-free samples was several times higher than in static cultures. Thus, it has been shown that the use of gels with a fibrin concentration of 5 mg/ml, resp. direct cell loading on a gel-free substrate is optimal for colonization of the titanium surface. The results of the dissertation can contribute to the improvement of osteointegration of titanium implants.