Metody molekulární biologie při studiu genetického vlivu a identifikaci řídících genů v experimentálním modelu infekčních nemocí

Abstract

Biomedicínské inženýrství hraje klíčovou roli ve vývoji a zlepšování metod používaných v molekulární biologii. Tyto metody umožňují práci s biologickým materiálem a jeho analýzu. Tím tyto metody přispívají k pokroku nových terapeutických strategií. Tato práce se zabývá diagnostickou částí biomedicínského inženýrství a zahrnuje vývoj inovativních přístupů a metod pro prevenci a diagnostiku nemocí. Klíčovým prvkem při detekci genetického základu nemocí je stanovení genotypu (genotypů) spojených s vnímavostí k nemocem. V této studii představujeme nově modifikovanou, robustní, levnou a bezpečnou metodu pro genotypizaci. Identifikovali jsme podmínky, za kterých lze zvýšit rozlišení genotypizační metody až na rozdíl 6 nukleotidů. Provedli jsme důkaz konceptu této metody ve studiích pro dvě různá infekční onemocnění: leishmanióza a klíšťová encefalitida (TBEV). Vybrali a genotypovali jsme experimentální populace ve studii mikrobiomu spojeného s leishmaniózou. Tato analýza potvrdila genetické pozadí myších kmenů, které se liší svou vnímavostí k infekci parazity Leishmania major, a umožnila nám zhodnotit vliv genotypu a infekce na složení mikrobioty. Mikrobiální komunity v ileu a tlustém střevě testovaných kmenů byly porovnány pomocí lineární diskriminační analýzy efektu velikosti (LefSe) a shlukové analýzy. Ukázali jsme, že infekce parazity rodu Leishmania ovlivňuje hlavně mikrobiotu ilea, zatímco bakteriální komunita v tlustém střevě byla stabilnější. Získané výsledky naznačují rozdíly ve složení mikrobioty mezi rezistentními a vnímavými kmeny. Tuto genotypizační metodu jsme také úspěšně použili pro mapování nového lokusu na chromozomu 7, který kontroluje přežití po infekci TBEV. Kombinace bioinformatiky a systémové analýzy založené na definici vzorců genové exprese, klasifikaci jednotlivých genů do ontologických drah a použití specifických genetických polymorfismů ovlivňujících nemoc vedla k detekci devíti kandidátních genů v tomto lokusu. Prokázali jsme užitečnost vylepšené metody genetického typování ve studiích náchylnosti k nemocem. Získané výsledky by mohly mít velký potenciál pro translační medicínu a tím pro zlepšení lidské zdravotní péče.

Biomedical engineering plays a crucial role in the development and improvement of methods used in molecular biology. These methods enable the manipulation and analysis of biological material and thus contribute to the advancement of new therapeutic strategies. This thesis deals with the diagnostic-oriented part of biomedical engineering and includes development of innovative approaches and methods for the prevention and diagnosis of diseases. A key element in detection of genetic basis of disease is establishment of genotype(s) associated with the disease susceptibility. In this study, we present a newly modified, robust, cheap and harmless method for genotyping. We have identified the conditions under which the resolution of the genotyping method can be increased to a difference of 6 nucleotides or even less. We performed proof of concept of this method in studies of two different infectious diseases: leishmaniasis and tick borne encephalitis (TBEV). We determined and tested experimental populations in a study of the microbiome associated with leishmaniasis. This analysis confirmed genetic background of mouse strains that differ in their susceptibility to Leishmania major and enabled us to impact of genotype and infection on the microbiota. Microbial communities in the ileum and colon of the tested strains were compared by Linear discriminant analysis Effect Size (LefSe) and cluster analysis. We shown that Leishmania infection affects mainly the ileum microbiota, whereas the colon bacterial community was more stable. Obtained results indicate differences of microbiota composition among resistant and susceptible strains. We also successfully used this method for mapping a new TBEV survival-controlling locus on chromosome 7. Combination of bioinformatics and a systems analysis based on the definition of gene expression patterns, the classification of individual genes into ontological pathways and the use of specific genetic polymorphisms affecting disease led to detection of nine candidate genes in this locus. Consequently, we proved usefulness of the improved method of genetic typing in studies of susceptibility to diseases. The obtained results could have a great potential for translational medicine and thus for improving human healthcare.