Studium interakcí kovových nanočástic a mikrobiologických objektů prostřednictvím pokročilých mikroskopických metod

Abstract

Rostoucí rezistence mikromycetních patogenů na léčbu abiotickými přípravky představuje významné celosvětové riziko 21. století.Mikromycetní infekce způsobující závažná invazivní a diseminovaná onemocnění spojené s vysokou mírou přidružené mortality jsou vážnou hrozbou pro současnou medicínu zejména imunodeficientních pacientů. Prioritou mnohých vědecko-výzkumných pracovišť po celém je nalezení inovativních metod vývoje antifungálních léčiv, které by umožnily eliminaci těchto mikroorganismů a nastavení takové metodologie, která zajistí reprodukovatelné informace o fyziologickém stavu daných mikroorganismů po působení antifungálních prostředků. Mikromyceta patří mezi eukaryota, jsou tedy strukturně složitější než prokaryotní buňky, a zároveň je jejich růst odlišný od jednobuněčných eukaryot, kterými jsou například kvasinky. Mikromyceta vytváří jak biofilmy, tak velmi odolné asexuální spory, které umožňují překonání náročných či nehostinných podmínek i po dobu několika let. V této souvislosti jsou v rámci této disertační práce studovány aplikační účinky stříbrných biosyntetizovaných nanočástic a abiotický vliv nízkoteplotního plazmatu. Byl proveden základní výzkum vlivu biosyntetizovaných nanočástic na morfologii buněčného povrchu vybraného mikroorganismu Candida albicans, který patří dle World Health Organization mezi patogeny v kategorii kritického rizika pro světovou populaci a veřejné zdraví. Zároveň byla provedena studie vlivu nízkoteplotního plazmatu na morfologii buněčných povrchů vybraných mikromycetních organismů druhů Alternaria alternata, Aspergillus niger, Fusarium graminearum a Fusarium culmorum. Aplikace nízkoteplotního plazmatu na mikromycetní organismy byla do současné doby opomíjena. Výzkum této práce uzavírá studium morfologie struktur vybraných mikromycetních spor a C. albicans. Byly zjištěny morfologické změny mikrobiálních struktur vybraných patogenů prostřednictvím pokročilých mikroskopických metod SEM, STEM-in-SEM, AFM a FIB-SEM. Aplikace těchto metod prokázala antifungální působení biosyntetizovaných stříbrných nanočástic na C. albicans, včetně potvrzení přítomnosti nanočástic na buněčném povrchu a fungicidní efekt působení netermálního plazmatu na uvedené mikromycetní druhy. Bylo experimentálně zjištěno, že je možné zobrazování spor pomocí SEM bez nutnosti aplikace vodivého povlaku na vzorky. Byla zobrazena vnitřní struktura vybraných mikromycet, která byla provedena tomografickými řezy C. albicans a zároveň demonstrovala poškození vnitrobuněčné stavby mikromycetních buněk zejména druhu A. alternata vlivem nízkoteplotního plazmatu. Výsledky této disertační práce přispěly k výběru vhodného účinného typu polydisperzních nanočástic, jehož výzkum v oblasti abiotického působení na C. albicans v současné době pokračuje s aplikačním cílem v nemocničním prostředí (léčiva, antifungální í obvazy, nátěry a úpravy povrchů). Zjištěná vysoká účinnost netermálního plazmatu na inaktivaci spor a eradikaci biofilmu plísní je využitelná pro humánní i veterinární léčbu fungálních onemocnění kůže a zároveň je vhodná pro sterilizaci a dekontaminaci povrchů, kde doposud běžně používané UV záření není dostatečně účinné.

The increasing resistance of micromycete pathogens to abiotic treatments represents a significant global risk in the 21st century. Micromycete infections causing severe invasive and disseminated diseases with high associated mortality rates are a serious threat to contemporary medicine, particularly for immunodeficient patients. Finding innovative methods of antifungal drug development to eliminate these microorganisms and setting up a methodology that provides reproducible information on the physiological state of the microorganisms after antifungal treatment is a priority for many research institutes around the world. Micromycetes are eukaryotes, thus structurally more complex than prokaryotic cells, and their growth is different from that of unicellular eukaryotes such as yeasts. Micromycetes produce both biofilms and highly resistant asexual spores that allow them to survive harsh or inhospitable conditions for several years. In this context, the application effects of silver biosynthesized nanoparticles and the abiotic effect of low-temperature plasma are studied in this dissertation. Basic research of the effect of biosynthesized nanoparticles on the cell surface morphology of a selected microorganism Candida albicans was performed, which according to the World Health Organization belongs to pathogens in the category of critical risk for the world population and public health. At the same time, the study of the effect of low-temperature plasma on the morphology of cell surfaces of selected micromycete organisms of Alternaria alternata, Aspergillus niger, Fusarium graminearum and Fusarium culmorum species was performed. The application of low-temperature plasma on micromycete organisms has been neglected until now. The research of this thesis concludes the study of the morphology of the structures of selected micromycete spores and C. albicans. The morphological changes in the microbial structures of the selected pathogens were determined by advanced microscopic methods such as SEM, STEM-in-SEM, AFM and FIB-SEM. The application of these methods demonstrated the antifungal effect of biosynthesized silver nanoparticles on C. albicans, including the confirmation of the presence of nanoparticles on the cell surface and the fungicidal effect of non-thermal plasma treatment on these micromycete species. It has been experimentally established that imaging of spores by SEM is possible without the requirement of applying a conductive coating to the samples. The internal structure of selected micromycetes was imaged by tomographic sections of C. albicans, demonstrating the damage to the intracellular structure of micromycete cells, particularly of the species A. alternata, due to low-temperature plasma. The results of this dissertation contributed to the selection of a suitable effective type of polydisperse nanoparticles, the research of which in the field of abiotic action on C. albicans is currently ongoing with application goals in hospital settings (pharmaceuticals, antifungal dressings, coatings and surface treatments). The observed high efficacy of non-thermal plasma for spore inactivation and biofilm eradication of fungi is applicable for human and veterinary treatment of fungal skin diseases and is also suitable for sterilization and decontamination of surfaces where the commonly used UV radiation is not sufficiently effective.