Účinná bioremediace toxického odpadu pomocí nových nitrilas

Abstract

Wastewater from certain industrial processes (gold and silver mining, electroplating with Cu, Ag and other metals, coal coking) contains high concentrations of free cyanide (hydrogen cyanide and cyanide ions; fCN) and can pose a threat to environmental safety. Modern approaches to wastewater treatment are primarily based on (physico)chemical methods and a final biological treatment with mixed microbial cultures. Enzymatic removal of fCN represents an environmentally promising approach. This work focuses on the remediation potential of enzymes from the nitrilase superfamily. In fungi, hypothetical nitrilases and cyanide hydratases were found through database searches. Selected enzymes were overproduced in Escherichia coli, purified and characterized, and their remediation potential was evaluated based on these results. Two of the enzymes belonged to the NIT4-type nitrilases (EC 3.5.5.4) according to their amino acid sequences: the NitTv1 enzyme from Trametes versicolor (protein XP_008032838.1) and the NitAb enzyme from Agaricus bisporus (protein XP_006462086.1). NIT4-type nitrilases are widespread plant enzymes that transform -cyano-L-alanine (AlaCN), an intermediate of fCN scavenging. AlaCN is converted to utilizable amino acids by NIT4. In this work, these enzymes were described for the first time in fungi. The fungal enzymes NitTv1 and NitAb exhibited high specific activities with AlaCN − approximately 132 and 40 U/mg of protein, respectively. In addition, the substrate specificity of these enzymes went beyond plant NIT4, as they could also transform other nitriles (phenylpropionitrile, cinnamonitrile, fumaronitrile). The stability properties were better for NitTv1 than NitAb. Presumably, these nitrilases play a role in plant-fungus interactions, allowing fungi to detoxify plant nitriles. Cyanide hydratases (CynHs) (EC 4.2.1.66) convert fCN into the much less toxic formamide and have been therefore considered for the decontamination of cyanide effluents. The purified CynH from Exidia glandulosa (protein KZV92691.1, enzyme NitEg) showed 5 high activity towards fCN with 784 U/mg of protein, kcat (turnover number) of 927/s, and kcat/KM (catalytic efficiency) of 42 l/s/mmol. pH and temperature optimum were 6–9 and 40–45 °C, respectively. Thus, the catalytic properties of NitEg surpassed those of the second CynH studied, which was from the fungus Stereum hirsutum (protein XP_007307917.1, enzyme NitSh). High concentrations of silver and copper (1 mM) reduced the activity of NitEg by 30–40%, whereas phenol, thiocyanate, sulfide, and ammonia, at levels typical for industrial effluents, did not lead to a significant reduction in fCN conversion. The enzyme was also functional at high fCN concentrations (100 mM), which is relevant to the remediation of wastewater from metal electroplating. NitEg is thus a promising biocatalyst for direct fCN detoxification, and NIT4 was shown to likely play an important role in fCN detoxification by fungi. Both enzymes are thus prospective for the detection and determination of fCN. Nevertheless, the potential of the enzymes is just emerging and requires further intensive research to improve and scale up their production and application.

Odpadní vody z některých průmyslových procesů (těžba zlata a stříbra, galvanické pokovování Cu, Ag a dalšími kovy, koksování uhlí) obsahují vysoké koncentrace volného kyanidu (kyanovodík a kyanidové ionty) a mohou představovat hrozbu pro bezpečnost životního prostředí. Moderní přístupy k čištění odpadních vod jsou založeny především na (fyzikálně)-chemických metodách a konečném biologickém čištění pomocí směsných mikrobiálních kultur. Enzymatické odstraňování volného kyanidu představuje přístup šetrný k životnímu prostředí. Tato práce se zaměřuje na remediační potenciál enzymů z nadrodiny nitrilas. U hub byly pomocí vyhledávání v databázích identifikovány hypotetické nitrilasy a kyanidhydratasy. Vybrané enzymy byly nadprodukovány v heterologním hostiteli (Escherichia coli), purifikovány a charakterizovány a na základě těchto výsledků byl vyhodnocen jejich remediační potenciál. Dva z enzymů patřily podle aminokyselinových sekvencí k nitrilasám typu NIT4 (EC 3.5.5.4): enzym NitTv1 z houby Trametes versicolor (protein XP_008032838.1) a enzym NitAb z houby Agaricus bisporus (protein XP_006462086.1). Nitrilasy typu NIT4 jsou široce rozšířené rostlinné enzymy, které přeměňují β-kyano-L-alanin (AlaCN), meziprodukt detoxifikace a utilizace volného kyanidu. AlaCN je pomocí nitrilasy NIT4 přeměňován na využitelné aminokyseliny. V této práci byly tyto enzymy poprvé popsány u hub. Fungální enzymy NitTv1 a NitAb vykazovaly vysoké specifické aktivity pro AlaCN - přibližně 132, resp. 40 U/mg proteinu. Substrátová specifita těchto enzymů byla navíc širší ve srovnání s rostlinnou nitrilasou NIT4. Fungální enzymy přeměňovaly i jiné nitrily (fenylpropionitril, nitril kyseliny skořicové, fumaronitril). Stabilita byla lepší u NitTv1 než u NitAb. Pravděpodobně tyto nitrilasy hrají roli v interakcích mezi rostlinami a houbami a umožňují houbám detoxikovat rostlinné nitrily. 7 Kyanidhydratasy (EC 4.2.1.66) přeměňují volný kyanid na mnohem méně toxický formamid, a proto se o nich uvažuje jako o enzymu pro dekontaminaci kyanidových odpadních vod. Purifikovaná CynH z houby Exidia glandulosa (protein KZV92691.1, enzym NitEg) vykazovala vysokou aktivitu pro volný kyanid (asi 784 U/mg proteinu), kcat (číslo přeměny) 927/s a kcat/KM (katalytická účinnost) 42 l/s/mmol. pH a teplotní optimum byly 6-9 a 40-45 °C. Katalytické vlastnosti NitEg tak předčily vlastnosti druhého studovaného enzyme, CynH, který pocházel z houby Stereum hirsutum (protein XP_007307917.1, enzym NitSh). Vysoké koncentrace stříbra a mědi (1 mM) snížily aktivitu NitEg o 30-40 %, zatímco fenol, thiokyanát, sulfid a amoniak v koncentracích typických pro průmyslové odpadní vody nevedly k významnému snížení konverze fCN. Enzym byl funkční i při vysokých koncentracích fCN (100 mM), což je důležité pro sanaci odpadních vod z galvanického pokovování. NitEg je tedy slibným biokatalyzátorem pro přímou detoxikaci fCN a ukázalo se, že NIT4 pravděpodobně hraje důležitou roli při detoxikaci fCN houbami. Oba enzymy jsou také perspektivní pro detekci a stanovení fCN. Nicméně potenciál těchto enzymů se teprve objevuje a vyžaduje další intenzivní výzkum ke zlepšení a rozšíření jejich výroby a použití.