Fotopulzní statistika a spektrální analýza ultraslabé fotonové emise z biologických systémů

Abstract

Biologická autoluminiscence (BAL), známá také pod pojmem ultraslabá fotonová emise (UPE), je endogenní bioluminiscencní fenomén, vlastní všem organismum s aktivním oxidativním metabolismem, vznikající díky chemickým reakcím vedoucím k elektronove excitovaným stavum. BAL zrcadlí zmeny oxidativního metabolismu vzniklé napríklad zmenou okolního prostredí ci prítomnosti biologických cinitelu. Hlavní cíle dizertacní práce jsou: (I) vytvorit metodiku merení BAL; (II) zhodnotit statistické a spektrální vlastnosti namerených BAL signálu; (III) navrhnout metodu pro zlepšení analýzy BAL signálu; (IV) vymyslet nový typ experimentu demonstrující využitelnost BAL v praxi. V první cásti dizertacní práce jsem navrhla svetlotesnou komoru pro merení BAL a urcila vhodné biologické vzorky a detektory. Dále jsem vypracovala metodiku pro BAL merení. Výsledky z diferencovaných bunek HL-60 a kvasinkových bunek ukazují oxidativní zmenu v BAL signálech pri zmenách podmínek merení ci použití antioxidantu. V následující cásti jsem se zabývala fotopulzní statistikou BAL signálu z klícících semínek munga ve vode nebo roztoku 1% sacharózy. Distribuce obou skupin byla ve shode s negativní binomickou distribucí po dobu 6 dnu, kdy strední hodnota postupne narustala a Fano faktor klesal. Porovnáním optické spektrální analýzy BAL z diferencovaných bunek HL-60 a kvasinkových bunek jsem demonstrovala rozdílná spektra v závislosti na daném biologickém systému. Dále jsem navrhla model odhadující množství generovaných fotonu uvnitr lidské kuže na jednotlivých vlnových délkách, který zahrnuje jejich útlum v jednotlivých vrstvách pri pruchodu k povrchu kuže. Nakonec jsem navrhla metodu predzpracování pro nestacionární signály, pro které platí rovnost strední hodnoty a rozptylu jako jsou napríklad Poissonovské procesy. Tato metoda zachovává typ distribuce a strukturu dat signálu ve fázovém prostoru. Duležitost navrhovaného predzpracování byla demonstrována na analýze Fano faktoru a Hurstove exponentu. V záverecné cásti jsem provedla experiment demonstrující využití BAL k zobrazení prostorových nehomogenit tedy lokálních rozdílu oxidativního stresu v predem definovaných podmínkách. Experiment byl proveden na lidské kuži, ukazující schopnost kvantitativne rozlišit nekolik stupnu oxidace vyvolané peroxidem vodíku H2O2 a možnost pozorovat ochranné úcinky antioxidantu. Z dizertacní práce vyplívá, že BAL je neinvazivní, neprímá metoda merení oxidativních procesu v biologických vzorcích v reálném case bez použití externích zdroju a markeru a je využitelná v praxi.

Biological autoluminescence (BAL), also known as ultra-weak photon emission (UPE), is an endogenous bioluminescent phenomenon present in all biological samples with an active oxidative metabolism caused by the chemical formation of electronically excited species. BAL can reflect changes in oxidative metabolism due to differences in the surrounding environment or the presence of biological agents. The main aims of this dissertation include (I) developing a methodology for BAL measurement; (II) examining the statistical and spectral properties of measured BAL signals; (III) devising a new method for improving BAL signal analysis and (IV) designing a new type of experiment demonstrating the practical usability of BAL. At the outset, a light-tight chamber was designed to ensure a dark environment. Biological samples and detectors were selected, and a measuring methodology for BAL was developed. Preliminary BAL results from human leukemia (HL-60) cells and yeast cells were presented, demonstrating oxidative changes under different measurement conditions or using an antioxidant. In the subsequent part, mung bean seedlings were investigated during growth in two different media: pure water or 1% sucrose. Their photocount distributions of BAL time series followed the negative binomial distribution with mean BAL values increasing during seedling growth, while Fano factor values showed a decreasing trend through the days. Optical spectral analyses of BAL from differentiated HL-60 cells and yeast cells revealed clear differences between them. Additionally, an optical model of BAL propagation through the human skin at selected wavelengths was created to estimate the initial intensity generated inside the skin. A preprocessing method for non-stationary signals with dependence between the mean and variance, typical for a Poisson-like process, was developed, preserving the type of photocount distribution and phase-space structure of the signal. The importance of the suggested pre-processing method was demonstrated by Fano factor and Hurst exponent analysis. In the final part, an experiment was conducted, demonstrating the capability of quantitative differentiation between several degrees of oxidation level on human skin in vivo induced by the application of H2O2 and the possibility of monitoring the protective effect of antioxidants. The imaging of BAL identified spatial inhomogeneity and local differences in oxidative stress under controlled conditions. Overall, the results of this dissertation demonstrate that BAL is a label-free, real-time, non-contact, non-invasive, and likely the only technique that requires no additional acute external energy input to the biosystem to observe endogenously or exogenously triggered oxidation processes.