Kompaktní mikroskopie se strukturním osvětlením a hodnocení výkonu v superrezolučním zobrazování živých buněk

Abstract

Mikroskopie se strukturním osvětlením (structured illumination microscopy – SIM) je jedním z nejpoužívanějších způsobů ve fluorescenční mikroskopii, jak dosáhnout prostorového rozlišení za hranicí difrakčního limitu. SIM, jako metoda schopná tzv. superrozlišení (super-resolution – SR), zdvojnásobuje prostorové rozlišení optického mikroskopu, což je dostatečné pro vizualizaci buněčných organel a jejich substruktur o velikosti _100 nm. Současné komerčně dostupné SR-SIM mikroskopy jsou často finančně nedostupné pro mnoho biologických laboratoří a jsou relativně objemnými systémy pokrývajícími více než jeden optický stůl. Vysoká poptávka po levných kompaktních SR-SIM mikroskopech vede k vývoji nových systémů, využívajících alternativní způsoby generování pruhovaného vzoru osvětlení nezbytného pro SIM rekonstrukci, např. pomocí digitálního mikrozrcadlového zařízení (digital micromirror device – DMD), feroelektrického mikrodispleje z tekutých krystalů (ferroelectric liquid crystal on silicon – FLCOS) nebo vláknové optiky. Tato práce podrobně popisuje vývoj nového SIM zařízení využívající komponenty vláknové optiky (fiberSIM). Navrhovaný SIM systém poskytuje slibné výsledky v oblasti super-resolution mikroskopie potvrzující tento koncept a ukazuje, že fiberSIM by se mohl stát základem pro univerzálního “Plug&Play” modulu schopný proměnit jakýkoli konvenční mikroskop v SR-SIM zařízení. Práce dále představuje pět volně dostupných SIM datových sad s kompletní dokumentací. Tato SIM data poskytují referenci nezbytnou pro další vývoj rekonstrukčních algoritmů nebo nástrojů pro analýzu v SR-SIM mikroskopii. Posledním krokem ve vývoji SR mikroskopu je kvantitativní vyhodnocení zlepšení rozlišení. V této práci je představena nedávno vyvinutá technika odhadu rozlišení založená na analýze kruhově průměrované spektrální výkonové hustoty (circular average power spectral density – PSDca). Navržená metoda umožňuje určit limit rozlišení z jednoho snímku, což je vhodné pro analýzu videosekvencí živých buněk. Práce dále pojednává nejpoužívanější konvenční techniky hodnocení rozlišení, které jsou schopny měřit skutečné meze rozlišení mikroskopu. Kombinace kompaktní nízkonákladové osvětlovací jednotky pro SIM s open-source algoritmy pro rekonstrukci a analýzu zpřístupňuje SR-SIM mnoha biologickým laboratořím.

Structured illumination microscopy (SIM) is one of the most common means of achieving a spatial resolution beyond the diffraction limit in fluorescence microscopy. The superresolution SIM doubles the spatial resolution of optical microscopy, which is sufficient to visualize cellular organelles and their substructures at _100 nm. Current commercially available SR-SIM microscopes are often unaffordable to many biological laboratories and are relatively bulky systems covering more than one optical table. The high demand for inexpensive compact SR-SIM microscopes leads to the development of the custom-built systems using alternative ways of generating the striped illumination pattern essential for the SIM reconstruction, e.g., using a digital micromirror device (DMD), a ferroelectric liquid-crystal-on-silicon (FLCOS) microdisplay, or fiber optics. This thesis details development of a novel custom-built structured illumination microscopy system based on all-fiber optic components (fiberSIM). The proposed SIM system provides promising super-resolution results confirming the concept and indicates that fiberSIM could become the basis of a versatile “Plug&Play” illumination module with the capability of turning any conventional microscope into the SR-SIM microscope. Furthermore, five freely available SIM datasets with complete documentation are introduced. This SIM data provides a benchmark essential for the further development of reconstruction algorithms or analysis tools in SR-SIM microscopy. The final step in the development of a custom-built SR microscope is the quantitative evaluation of the resolution gain. In this thesis, a recently developed resolution estimation technique based on circular average power spectral density (PSDca) analysis is introduced. The proposed method allows to determine the resolution limit from a single image, which is suitable for the analysis of video sequences of a living cell. Furthermore, the most common conventional resolution assessment techniques that are able to measure the actual resolution limits of a microscope are discussed. The combination of a compact low-cost SIM illumination unit with open-source reconstruction and analysis algorithms makes SR-SIM available to any biological laboratory.