Studium fázových přechodů vybraných materiálů pro kultivaci a kryoprezervaci buněk

Abstract

Diplomová práce se zabývá studiem fázových přechodů vybraných materiálů pro kryoprezervaci. Cílem diplomové práce bylo porovnání konvenčních kryoprotektantů (dimethylsulfoxid, trehalóza) s kryoprotektanty ve fázi výzkumu/testování (antifreeze protein Trx-ApAFP752 (AFP), tetrapeptid Pro-Ala-Gly-Tyr). Materiály byly studovány fyzikálními/biofyzikálními metodami: Ramanovou spektroskopií, diferenciální kompenzační kalorimetrií (DSC) a rentgenovou krystalografií (XRD). V Ramanovských spektrech byla sledována intenzita a pološířka pásu ledu (3100 cm-1). Pomocí DSC byly měřeny fázové přechody (teploty tání/tuhnutí) vodních roztoků. Pomocí XRD byly změřeny velikosti a orientace krystalů vody. Viabilita buněk (cytotoxicita materiálů) po aplikaci kryoprotektiv byla určena průtokovou cytometrií. Stav jader mražených buněk byl monitorován konfokální fluorescenční mikroskopií. Provedeným výzkumem jsme zjistili, že dimethylsulfoxid je nejefektivnější kryoprotektant a XRD bylo zjištěno, že má nejmenší krystality. Trehalóza vytváří souhlasné klastry (XRD). AFP má největší termální hysterezi (18 °C). Tetrapeptid Pro-Ala-Gly-Tyr byl nejméně známý a prostudovaný kryoprotektant. Ve zmraženém roztoku nedochází k významné změně velikosti krystalů ledu. PAGY posouvá teplotu mražení roztoku, bod tání je prakticky totožný se standardním ledem.The Master thesis deals with the treatment and study of phase transitions of selected materials for the cryopreservation. The goal of the thesis was the comparison of conventional cryoprotectants (dimethyl sulfoxide, trehalosis) with cryoprotectants in research stage (antifreeze protein Trx-ApAFP752, tetrapeptide Pro-Ala-Gly-Tyr). The materials were performed by the following methods: Raman spectroscopy, differential scanning calorimetry (DSC) and X-ray crystallography (XRD). A Raman peak at 3100 cm-1 with the intensity and full width at half maximum FWHM was observed in the Raman spectrum. Water solutions phase transitions were obtained by DSC. X-ray diffraction was used to quantify the magnitude and orientation of crystallites. After application of cryoprotectants the Viability of cells was determined by flow cytometry. In this work the most effective cryoprotectant is dimethyl sulfoxide with the smallest diameter of crystallites discovered by XRD. Trehalose forms clusters in water solutions (XRD). Antifreeze protein has the largest thermal hysteresis (18 °C). Tetrapeptide Pro-Ala-Gly-Tyr is the most unknown material. It doesn't disturb crystallizing solution either the shift of the thaw temperature to lower values.