Monitorování procesu hybridizace DNA nanostruktur pomocí rozptylu světla

Abstract

Tato diplomová práce se zaměřuje na sledování a optimalizaci procesu hybridizace DNA nanostruktur pomocí rozptylu světla. Cílem bylo ověřit vhodnost této metody pro monitorování skládání různých typů DNA origami struktur (12-helix bundle, Rothemundův trojúhelník, obdélník) a navrhnout úpravy hybridizačního protokolu vedoucí ke zkrácení celkového času přípravy, aniž by došlo ke ztrátě kvality výsledných struktur. K experimentálním metodám patřilo měření intenzity rozptylu světla při postupném ochlazování vzorků a následná vizualizace struktur pomocí mikroskopie atomárních sil (AFM). Dále byl analyzován vliv fyzikálních a technických parametrů, jako je objem kyvety, koncentrace vzorku, přítomnost bublin a evaporace, na stabilitu a přesnost měření. Výsledky ukazují, že metoda rozptylu světla je vhodná pro sledování hybridizace DNA nanostruktur v reálném čase a umožňuje posoudit dynamiku skládání. U struktur Rothemundova trojúhelníku a obdélníku se podařilo hybridizační dobu výrazně zkrátit (až o 50 % u Rothemundova trojúhelníku a o 70 % u obdélníku) bez negativního dopadu na kvalitu výsledných struktur, což bylo potvrzeno AFM analýzou. Naproti tomu u 12-helix bundle se ukázalo, že je nutné vyvinout samostatný hybridizační protokol přizpůsobený prostorové architektuře a vyšší složitosti této nanostruktury. Diskuse se věnuje interpretaci rozptylových křivek, porovnání 2D a 3D struktur a úvaze nad vlivem konstrukčních parametrů na úspěšnost skládání. V závěru je potvrzena vhodnost rozptylu světla jako rychlé, neinvazivní metody pro monitorování hybridizace a formulována doporučení pro další optimalizaci protokolů pro různé typy DNA nanostruktur.

This diploma theses focuses on the monitoring and optimization of the hybridization process of DNA nanostructures using light scattering. The aim was to verify the suitability of this method for tracking the assembly of various types of DNA origami structures (12-helix bundle, Rothemund triangle, rectangle) and to propose modifications to the hybridization protocol to shorten the overall preparation time without compromising the quality of the resulting structures. The experimental methods included measuring the light scattering intensity during gradual cooling of the samples and subsequent structural visualization using atomic force microscopy (AFM). Additionally, the influence of physical and technical parameters such as cuvette volume, sample concentration, presence of air bubbles, and evaporation on the stability and accuracy of the measurements was analyzed. The results show that light scattering is a suitable method for real-time monitoring of DNA nanostructure hybridization and enables evaluation of the folding dynamics. For Rothemund triangle and rectangular structures, it was possible to significantly shorten the hybridization time (by up to 50 % for Rothemund triangle and 70 % for rectangles) without negatively affecting the structural quality, as confirmed by AFM analysis. In contrast, for the 12-helix bundle, it was found necessary to develop a separate hybridization protocol tailored to its spatial architecture and higher structural complexity. The discussion addresses the interpretation of scattering curves, comparison of 2D and 3D structures, and considerations on how design parameters influence successful folding. In conclusion, light scattering is confirmed as a fast and non-invasive method for monitoring hybridization, and recommendations are formulated for further optimization of protocols for different types of DNA nanostructures.