Rozdíly v radiačním poškození restrikčních endonukleáz HindIII a PvuII způsobené fotonovým a protonovým zářením

Abstract

Předmětem studia této práce je vliv ionizujícího záření na aktivitu enzymů PvuII a HindIII. Tyto dva enzymy patří mezi restrikční endonukleázy typu II, které rozpoznávají na DNA specifické palindromické sekvence, v nichž za přítomnosti kofaktoru Mg2+ dvoušroubovici rozštěpí. PvuII štěpí molekulu DNA uprostřed sekvence CAG?CTG a HindIII štěpí DNA ve vyznačeném místě sekvence A?AGCTT. Jako řetězec DNA se známým pořadí bází byl použit plazmid pcDNA3, který má délku 5446 bázových párů (bp). Enzym PvuII štěpí tento plazmid ve třech místech a HindIII jej štěpí v jednom místě. Po inkubaci enzymu PvuII s plazmidem pcDNA3, dostaneme tři fragmenty DNA o délkách 1069, 1097 a 3280 bp. Pokud je plazmid rozštěpen enzymem HindIII, dostaneme místo stočené (supercoiled) formy plazmidu formu lineární. Pro rozlišení různě dlouhých úseků DNA byla použita metoda gelové elektroforézy. Bylo zjištěno, že část enzymů je deaktivována ionizujícím zářením a aktivita pevného množství enzymů klesá se vzrůstající dávkou ionizujícího záření. Ve snaze porovnat vliv kvality záření byly enzymy ozářeny protonovým, elektronovým a fotonovým svazkem. Provedené experimenty vedly ke zjištění, že oproti protonovému záření jsou enzymy ve vodním roztoku účinněji poškozovány fotonovým zářením. Výsledky experimentů jsou prezentovány a diskutovány s ohledem na molekulární strukturu obou enzymů.

The research focused on the influence of ionizing radiation on the activity of the restriction enzymes PvuII and HindIII. PvuII and HindIII are type II restriction endonucleases. They cleave DNA double helix at specific palindromic recognition sequences in the presence of the Mg2+ cofactor. PvuII and HindIII cleave the sequences CAG?CTG and A?AGCTT respectively; the cleavage occurs at the positions marked by the downward arrows. The plasmid pcDNA3 was used as the DNA substrate for the experimental study. It is 5446 basepairlong circular DNA molecule, contains three recognition sites for the enzyme PvuII, and one recognition site for the enzyme HindIII. After the correct interaction of pcDNA3 with PvuII, we thus obtain three plasmid fragments with lengths of 1069, 1097 and 3280 base pairs. When HindIII is incubated with the plasmid, the linear form of the plasmid is generated. The method for processing the cleaved DNA samples is standard agarose gel electrophoresis. The activity of the irradiated enzymes decreases in correspondence with the increasing dose of radiation due to a part of the enzymes being deactivated in the aftermath of the radiationinduced damage. To determine the effect of radiation quality, samples were irradiated using proton, electron and amma sources. We found out that photon radiation deactivates more enzyme units in the sample than a corresponding dose of proton radiation. The results of the experimental study are presented and discussed with respect to molecular structure of both enzymes, and particular sites of radical damage influencing their function.