Metody biomedicínského výzkumu při mapování genů modifikujících imunologické parametry a při analýze genové exprese

Abstract

Metodyanalýzygenové exprese, kterými jsou izolace RNA, RT PCR (vytvoření cDNA a PCR vreálném čase) a metody zahrnující proces zjišťování lokusů na chromosomech ovlivňujících imunologické parametry, do kterých patří izolace DNA, PCR a elektroforéza, Patří do velké rodiny metod biomedicínského výzkumu. Zvládnutí těchto metod je nezbytné pro úspěšné splnění cílů, které jsou stanoveny vzadání mé diplomové práce. Vprvní části mé práce jsem výsledky mých experimentů přispěl kurčení tří lokusůna chromosomech, které určitým způsobem ovlivňují imunologické parametryu neinfikovaných myší. Provedl jsem izolaci DNA a DNA typizaciu dvounezávislýchexperimentů, které dohromady zahrnovaly209 myších jedinců náležících k F2hybridům mezi kmeny O20 a OcB-43. Pro typizaci bylo vybráno 7 markerů: D2Mit14, D2Mit37, D2Mit126, D3Mit51, D5Mit43, D15Mit5 and D15Mit13. Následně bylo provedeno statistické vyhodnocení pomocí testu ANOVA vprogramu Statistica. Detekovali jsmetři lokusyna chromosomech 2, 3 a 5 ovlivňující velikost sekundárních lymfatických orgánůu neinfikovaných myší. Lokus na chromosomu 5 má hlavní efekt na regulaci počtu buněk u inguinálních lymfatických uzlin. Interakce mezi lokusy na chromosomu 2 a 3 ovlivňují relativní váhu sleziny. Vdruhé částimé práce jsem studovalgenovou expresy u čtyř genů: Synaptotagmin 14, Fcgamma receptor 4, Guanylate binding protein 1, Guanylate binding protein 5vmízních uzlinách, jak u zdravýchmyší, tak u myšínakažených prvokem Leishmania Major. Referenční gen spotvrzenou expresí představoval Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Pro studium expresse byloizolováno RNA z 13myších kmenů vminimálním zastoupení 6 myších jedinců z každé skupiny. Výsledky exprese zPCR vreálném čase byly porovnány sreferenčním genem Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Pomocí programu STATISTICA byly zjištěny rozdíly vexpresy genů mezi infikovanými a zdravými myšmi.

Methods ofanalysis ofgene expression, whichincludeRNA isolation, RT PCR (creating cDNA and real time PCR), and methods involving detection of loci influencing immunological parameters belong to a large family ofmethods in biomedical research. Mastering these techniques is essential for successful fulfillment of aims of my thesis. In the first part of my work I contributedto the determination of the three loci, whichhaveaffectatthe immunological parameters inuninfected mice. I performed DNA isolation and DNA typingin two independentexperiments, which together comprised 209 individuals belonging to the mouse F2hybrids between strains O20 and OCB-43. For typing were selected7 markers: D2Mit14, D2Mit37, D2Mit126, D3Mit51, D5Mit43, D15Mit5 and D15Mit13. Statisticalevaluation was performedbyANOVA in Statisticasoftware. We detected three loci on chromosomes 2, 3 and 5 influencing size of secondary lymphoid organsin uninfected mice. Locus on chromosome 5 has a major effect on the regulation of the number of cells in inguinal lymph nodes. Interactions between loci on chromosome 2 and 3 influences the relative weight of the spleen. In the second partof my thesis I studiedexpression offour genes: Synaptotagmin 14, Fcgamma receptor 4, Guanylate binding protein 1, Guanylate binding protein 5in lymph nodes of mice infected with Leishmania major. RNA samples were isolated from at least 6 infected and uninfectedmice from 12 different strains. The results of Real-time PCR were normalaiyed using Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseas a house keeping gene. Differences in expression genes in infected and uninfected mice of the same strain or between diffrent strains were analzyed using STATISTICA program.