Základní prvky pro vývoj biosenzorů na bázi diamantu pro detekci bakterií ve vodě
Essential elements towards the development of diamond-based biosensors for bacteria detection in water
Typ dokumentu
disertační prácedoctoral thesis
Autor
Lucie Dubovská
Vedoucí práce
Mortet Vincent
Oponent práce
Husák Miroslav
Studijní obor
Biomedicínská a klinická technikaStudijní program
Biomedicínská a klinická technika (4)Instituce přidělující hodnost
katedra přírodovědných oborůObhájeno
2024-09-19Práva
A university thesis is a work protected by the Copyright Act. Extracts, copies and transcripts of the thesis are allowed for personal use only and at one?s own expense. The use of thesis should be in compliance with the Copyright Act http://www.mkcr.cz/assets/autorske-pravo/01-3982006.pdf and the citation ethics http://knihovny.cvut.cz/vychova/vskp.htmlVysokoškolská závěrečná práce je dílo chráněné autorským zákonem. Je možné pořizovat z něj na své náklady a pro svoji osobní potřebu výpisy, opisy a rozmnoženiny. Jeho využití musí být v souladu s autorským zákonem http://www.mkcr.cz/assets/autorske-pravo/01-3982006.pdf a citační etikou http://knihovny.cvut.cz/vychova/vskp.html
Metadata
Zobrazit celý záznamAbstrakt
Detekce patogenních bakterií je nedílnou součástí environemtální a průmyslové bezpečnosti. Navzdory dobré selektivitě, jsou konvenční metody časově náročné a vyžadují specializovaný personál a laboratorní vybavení. Biosenzory jsou dobrými kandidáty pro monitorování v reálném čase a rychlou detekci patogenních agens. První část této práce shrnuje současný stav detekce celých bakteriálních buněk včetně konvenčních metod a biosenzorů. Je shrnut nejnovější vývoj v technologiích biosenzorů pro detekci bakterií ve vodních roztocích a potravinových vzorcích založených na různých transdukčních metodách (optických, elektrochemických a akustických). Jsou také diskutovány jejich výhody a nevýhody a jednotlivé metody jsou porovnány. Ve druhé části je věnována pozornost vývoji navrhovaného biosenzoru - diamantem pokrytý senzor s povrchovými Loveho akustickými vlnami (LW-SAW) jako převodník signálu a bakteriofágové proteiny vázající se na buňky E. coli jako bioreceptor. Teoretické simulace LW-SAW senzorů byli provedeny pro tři různé piezoelektrické substráty - křemen (ST-řez), tantalát litný a niobát litný, které podporují šíření horizontálních vln. Byli provedeny simulace disperzních křivek fázové rychlosti a elektromechanického vazebního koeficientu a fázová rychlost byla porovnána s experimentálními výsledky pro diamantem pokryté senzory z křemene a tantalátu litného s oxidem křemičitým jako vedoucí vrstvou. Experimentální výsledky se neshodují s teoretickými, což je výsledkem rozdílných mechanických vlastností materiálů použitých v simulacích a reálných vzorcích. Dva různé způsoby zvýšení citlivosti navrhovaných biosenzorů byly studovány - experimentální depozice diamantových zrn na LW-SAWsenzory místo spojité vrstvy a simulace použití diamantových fononových metamateriálů na povrchu LW-SAW senzorů. Krátká kapitola je také věnována použití vrstvy diamantu a karbidu křemíku jako pasivační vrstvy pro senzory bez nutnosti ochranného obalu, kdy byla potvrzena použitelnost obou materiálů. Byli úspěšně vyrobeny proteiny s his-tag značkou gp17, gp12 a ORF26 vázající bakteriální buňky E.coli. Imunofluorescenční test potvrdil, že ORF26 a gp17 se specificky vážou na bakterie E.coli, zatímco protein gp12 se vázal i na buňky bakterie Salmonella. Dva různé přístupy navázání těchto proteinů s his-tag značkou na bórem dotované diamantové vrstvy byli úspěšně vyvinuty: 1/ přímá elektrodepozice nikelnatých nanočástic a 2/ elektrochemická funkcionalizace následovaná chemií EDC/NHS pro navázání kyseliny NTA, která chelatuje ionty niklu. Pro potvrzení úspěšného navázání bakterií na funkcionalizované vrstvy musí být provedeny další experimenty. Poslední část je věnována studiu QCM senzorů s borem dotovanými diamantovými vrstvami pro biosenzorické aplikace. BDD vrstvy byli úspěšně nadeponované na QCM krystaly, ale funkcionalizace vrstev s následným přichycením bakteriálních buněk nebyla dosud úspěšně dokončena a vyžaduje další pozornost a vývoj. Přestože tato práce nevedla k vývoji fungujících biosenzorů na bázi diamantů, položila důležité stavební kameny. Citlivost LW-SAW senzorů s diamantovým povlakem není snížena natolik, jak se očekávalo z teoretických simulací, protože Youngův modul tenké CVD diamantové vrstvy je mnohem nižší než u objemového diamantu. His-tagované proteiny byly úspěšně vyrobeny a byly vyvinuty dva různé protokoly pro jejich připojení k borem dotovaným diamantovým vrstvám. Úspěšně bylo také dosaženo depozice nízkoteplotních BDD vrstev na senzory QCM. Výsledky této práce jsou slibné pro vývoj biosenzorů s duálním odečítacím systémem - spřaženou elektrochemickou a akustickou detekcí. Detection of pathogenic bacteria is an inherent part of environmental and industrial safety. In spite of good selectivity of conventional methods, they are time-consuming and labor-intensive. Biosensors are good candidates for real-time monitoring and fast detection of pathogenic agents. The first part of this Thesis resumes the state of the art of whole cell bacteria detection including conventional and biosensor methods. We summarize recent developments in biosensing technologies for bacteria detection in aqueous solutions and food matrices based on different transduction methods (optical, electrochemical and acoustic). Their advantages and disadvantages are discussed and compared. In the second part, studies towards the development of the proposed biosensor: diamond coated Love wave surface acoustic wave sensor as a transducer and Escherichia coli binding proteins as a bioreceptor, are presented. Theoretical simulations of LW-SAW sensors are carried out for three different piezoelectric substrates ST-cut quartz, 36YX LiNbO3 and 36YX LiTaO3, that can support the propagation of shear waves. Phase velocity vp and electromechanical coupling coefficient K2 dispersion curves were simulated and vp was compared to experimental results for the diamond/SiO2/ST-cut quartz and diamond/SiO2/36YX LiTaO3 structures. Experimental results have shown disagreement with the theoretical ones which is attributed to the different mechanical properties used in simulations and real samples. Two different approaches of sensitivity enhancement were studied - experimental deposition of diamond grains on LW-SAW sensors instead of continuous layer and simulation study of use of diamond phononic metamaterials on surface of LW-SAW sensors. A short simulation chapter is dedicated also to the use of diamond and silicon carbide layers as a passivation layer for package less sensors and the usability of both materials were confirmed. E.coli binding his-tagged proteins gp17, gp12 and ORF26 were successfully produced and purified. Immunofluorescent assays confirmed that ORF26 and gp17 bind specifically to the E.coli cells, gp12 showed binding also to the Salmonella cells. Two different approaches of attachment of these proteins to the boron doped diamond surface has been successfully developed: 1/ direct electrodeposition of nickel nanoparticles and 2/ electrochemical grafting followed by EDC/NHS chemistry for attachment of NTA acid that chelates nickel ions. Further experiments must be carried out to confirm bacteria binding on biosensors. The last part is devoted to the study of boron doped diamond coated QCM sensors for the biosensing applications. We successfully deposited BDD layers on the QCM crystals, but the functionalization of the layers followed by attachment of the bacteria was not successfully finished so far and it needs further attention and development. Even though the work did not lead to the development of the working diamond-based biosensors, it laid important building stones. Sensitivity of diamond-coated LW-SAW sensors is not reduced that much as was expected from the theoretical simulations, as the Young modulus of thin CVD diamond layer grown at low temperature is much lower than for the bulk diamond. The his-tagged tail fibers were successfully produced and two different protocols for their attachment to the boron doped diamond layers were developed. Also the deposition of low temperature BDD layers on QCMs sensors were successfully achieved. Results of this Thesis are promising for development of biosensors with dualread out system - coupled electrochemical and acoustic detection.