Výzkum potenciálního rozvoje antimikrobiální rezistence vůči fotoaktivním nanočásticím pod osvětlením

Abstract

Antimikrobiální rezistence (AMR) je zásadním problémem moderní společnosti. Proto vědci stále pátrají po způsobech jejího překonání. Protože jsou bakterie živými organismy, vyvíjí se v čase, a to včetně svých rezistentních mechanismů. Citlivost bakterie vůči antimikrobiální látce v jednom časovém okamžiku tedy nezaručuje dlouhodobou funkčnost látky jako antibiotika. Z tohoto důvodu je nutné posuzovat účinky dlouhodobého působení antimikrobiálních činidel během zkoumání perspektivních antibiotik. Tímto způsobem lze alespoň částečně odhalit vývoj antimikrobiální rezistence vůči dané látce. V této práci byly zkoumány osvětlené nanočástice oxidu zinečnatého pro jejich antimikrobiální účinky. Pro výzkum byly použity neletální bakterie Escherichia coli, které byly několikanásobně vystaveny subletálním koncentracím (100μg/ml) nanočástic oxidu zinečnatého a pěstovány v osobních bioreaktorech. Před samotným experimentem byl proveden předběžný výzkum pro zajištění přesných výsledků. Ten zahrnoval měření minimální inhibiční koncentrace a absorpčního spektra nanočástic oxidu zinečnatého i dalších faktorů ovlivňujících měření. Následně byly provedeny dva samostatné experimenty, ve kterých proběhlo testování čtyř samostatných vzorků – vzorku obsahujícího nanočástice oxidu zinečnatého, osvíceného vzorku, osvíceného vzorku obsahujícího nanočástice oxidu zinečnatého a reference, která byla neosvícená a neobsahovala nanočástice. Pro jejich vyhodnocení byla použita především data vývoje optické hustoty bakteriálních kultur v čase (buňky byly pěstovány v Mueller-Hintonově vývaru v osobních bioreaktorech) a měření jednotek tvořících kolonie ze vzorků odebíraných před a po vystavení oxidu zinečnatému na Mueller-Hintonově agaru. Z těchto dat byly dále získány dva parametry: délka lag fáze a maximální růstová rychlost. Data byla následně analyzována použitím neparametrického ekvivalentu dvoufaktorového ANOVA testu – Scheirer-Ray-Hare testu. Výsledky odhalily, že nevzniká antimikrobiální rezistence, ale naopak dochází u našich kultur ke zvýšené citlivosti vůči nanočásticím oxidu zinečnatého. Tento efekt byl pozorován u jednoho vzorku během obou experimentů během třetí expozice. Navíc byl pozorován pokles v rychlosti růstu a prodloužení lag fáze u těchto vzorků. Přestože výsledky tohoto experimentu nedetekovaly důkaz vzniku antimikrobiální rezistence vůči nanočásticím oxidu zinečnatého, neukazuje to na možnost bezmezného využívání této látky jako antibiotika. Antibakteriální nanočástice mohou být dlouhodobým řešením antimikrobiální rezistence, ale pokud se máme ponaučit z předchozího nadužívání a zneužívání antibiotických látek, musíme i tyto látky používat s nejvyšší opatrností, abychom zabránili vzniku další rezistence.

Antimicrobial resistance (AMR) is a significant problem for society and scientists are, therefore, constantly searching for methods of overcoming it. However, as bacteria are living organisms, bacterial resistance can develop in them over time. For this reason, when testing perspective antimicrobial agents, the effects of long-term exposure of cells to the agent should be studied to rule out the development of this resistance. In this thesis, the use of an illuminated photoactive nanoparticle (zinc oxide) as an antimicrobial agent was inspected. For this experiment, non-lethal Escherichia coli bacteria were repeatedly exposed to sub-lethal (100 μg/ml) concentrations of zinc oxide nanoparticles and grown in personal bioreactors. Prior to the experiment itself, preliminary experiments were carried out in order to ensure accurate results. These experiments included the measurement of the minimum inhibitory concentration and absorbance spectrum of zinc oxide nanoparticles, and other factors affecting the final measurement. For the re-exposure experiments themselves, four samples were tested - an un-illuminated sample containing zinc oxide nanoparticles, an illuminated sample, an illuminated sample containing nanoparticles, and a reference sample without illumination and nanoparticles. To evaluate the results of the two re-exposure experiments, colony forming unit (CFU) concentrations of cells after exposure to zinc oxide were measured on Mueller-Hinton agar plates. Optical density of the cell cultures (in Mueller-Hinton broth) was also measured during growth. From this data, lag phase lengths and maximum growth rates were extracted for evaluation. The data was then analyzed using a non-parametric variant of a two-factor ANOVA test called the Scheirer-Ray-Hare test. The results showed that, rather than forming antimicrobial resistance, cells exposed to zinc oxide nanoparticles became more sensitive to them over time. This effect was observed in one sample of each experiment in the third re-exposure step. Furthermore, a significant decrease in the growth rate of these suppressed samples was discovered as well as the prolongation of lag phases. Although the results of this thesis did not detect any evidence of bacteria developing resistance towards zinc oxide nanoparticles, this does not mean the material can be used with impunity. Antibacterial nanoparticles may be the long-term answer to combat AMR so if lessons are to be learned from the misuse and over-use of antibiotics, they must be used with the utmost care to prevent any possible resistance from developing.